肉用種母雞子宮陰道結合部及貯精管上皮細胞的凝集素染色研究

摘 要：哺乳動物的精子結合到與輸卵管尾部上皮細胞頂端表層上配糖體有關的末端碳水化合物上，并遭受與輸卵管前獲能有關的細胞和分子修飾。與此相反，雞的精子能在子宮陰道結合部（Uterovaginal Junction，UVJ）的精子儲存小管（Sperm-storage Tubules，SST）中儲存長達23 d。

目前，對于調節精子在SST中儲存和從中釋放的細胞學和分子學機理幾乎一無所知。本研究的目的是利用外源凝集素鑒定與SST上皮細胞表面相關聯的復合糖。

本研究使用了6～16周產蛋上有較高和較低受精率的未產蛋母雞和產蛋母雞。含SST的UVJ黏膜切片用熒光共軛凝集素染色，通過共聚焦顯微鏡鏡檢。與UVJ和SST上皮細胞有關的一部分碳水化合物在它們的凝集素結合模式上存在差異。

未產蛋母雞、幼齡母雞和老年雞在這兩種上皮細胞內的凝集素結合模式上有明顯差異，高受精率和低受精率的母雞則存在微小差異。僅對半乳糖和N-乙酰半乳糖胺成分有特異性的外源凝集素位于SST腔表面。

雖然儲存下來的精子可能被非常緊密地排列在SST上皮細胞頂端微絨毛上，但精子通過與復合糖相關的終端碳水化合物結合到微絨毛上，似乎并不是其延長儲存時間的必要條件。

然而，SST上皮細胞與儲存精子通過蛻落的微絨毛囊泡（其特征為表面含有終端半乳糖的復合糖和N-乙酰半乳糖胺成分）進行信息交流的可能性目前正在研究。

關鍵詞：輸卵管；精子儲存；肉種雞；復合糖

中圖分類號：S814 文獻標識碼：C 文章編號：1001-0769（2017）02-0022-07

雌性家禽在自然交配或人工授精之后能夠較長時間使精子保持活力。授精后，精子在陰道內會經歷強烈的選擇過程。被選中的精子群會被運輸到近卵巢方向的子宮陰道接合部（Utero-vaginal Junction，UVJ），隨后精子進入上皮細胞離散的管狀內陷部——精子儲存管（Sperm-storage Tubules，SST）中。

在隨后的數天或數周中，儲存在SST中的精子被逐步從SST中釋放出來，上行至輸卵管前端，并與隨后排出的卵相互作用完成受精。Bakst（1993；2011）、Das等（2008）和Froman等（2003）對SST上皮細胞及其周圍疏松結締組織細胞以及相對于SST中的和從SST釋放出儲存精子的精子行為的可能作用分別進行了綜述。

在哺乳動物中，復合糖通過選擇性地將精子結合到輸卵管峽部上皮細胞的頂部表面而使其成為構建精子儲存庫所必需的部分[參見Suarez（2008）、Talevi和Gualtieri（2010）的綜述]。

Ignotz等（2001）介紹了精子貯庫的三大功能：通過只允許相對較少的精子在排卵期到達受精的部位以減少多精入卵的可能性；維持精子在精子輸送到雌性動物體內至排卵這段時間內的精子活力和受精力；促進精子獲能并獲得極大的活力。

與雞精子質膜相關聯的復合糖參與陰道中的精子選擇、精子通過陰道向子宮陰道接合部的近子宮運輸（Froman和Engel，1989；Steele和Wishart，1996）及精子與內部卵黃周圍層間的相互作用。鄰近SST上皮細胞的雞精子呈緊密排列（Tingari和Lake，1973）或與SST上皮細胞相結合（Ahammad等，2011）的狀態。

Schuppin等（1984）認為，只有當火雞的SST腔內充滿了精子時，它們才能與SST微絨毛的頂端相接觸。然而，Bakst和Bauchan（2015）最近使用透射電鏡在火雞輸卵管的微絨毛和排列于SST上皮細胞微絨毛頂部之間觀察到了精子的頭部。

還必須確認的是：上述作者所述的精子和SST上皮細胞之間的這種緊密排列是否能夠由含碳水化合物的糖蛋白和/或糖脂介導、或者由于精子在SST中密實填充僅僅是并列排列（Tingari和Lake，1973）。有趣的是，Ashizawa和Nishiyama（1983）把雞精液與來自輸卵管不同區域的組織分離塊共同培養，并記錄下“……與來自其他區域的組織相比，觀察到精子與SST上皮細胞緊密結合”。

因此，本研究的目的是鑒定與SST頂部表面相關聯的碳水化合物成分。這些研究結果將可作為未來進一步研究SST管腔中精子/上皮細胞間互作的基礎信息。此外，本研究還可了解與UVJ和SST上皮細胞相關聯的碳水化合物成分的分布情況。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

試驗采用羅斯308肉種雞，按標準飼養條件飼養（Aviagen公司生產）；20周齡時轉入蛋雞籠，進行單籠飼養，雞舍環境可控；21周起進行光照刺激（光周期為14 h光照∶10 h黑暗）。母雞在24周齡時進行首次人工授精，此后每周進行一次人工授精，每次輸入3億個精子（3×108個）。每天收集種蛋并儲存在 18 ℃的冷藏室中，每周孵化，照蛋檢測種蛋的受精情況。本研究中，受精率在90%以上者設為高受精率個體，低于80%以下者為低受精率個體。

1.2 組織收集和組織學

母雞在產蛋第6周（n=5）、第11周（n=4）、第14周（n=8）和第16周（n=7）后采用頸脫位法實施安樂死，隨后將子宮和陰道作為一個整體分離。另一組6羽未產蛋母雞同樣在產蛋后第6周實施安樂死。去除包圍子宮和陰道后端的結締組織，露出UVJ，用立體顯微鏡定位SST（Bakst，1992）。從每羽母雞中分離2～4塊含有SST的UVJ黏膜樣本，隨后放入10%中性緩沖福爾馬林（Neutral Buffered Formalin，NBF）中固定。

經過24 h～48 h的固定后，樣品轉移到濃度為70%（V/V）的乙醇溶液中，每30 min更換一次乙醇，共更換2次，然后轉移到自動化系統的組織處理器中，最后用石蠟包埋。每個樣本切4～6個切片、每片厚4 μm，并依次收集到載玻片上，置于37 ℃的暖托盤中風干，在室溫條件下儲存直到切片染色。染色包括蘇木精和曙紅（HE；Llewellyn，2009）、PAS反應（Bancroft和Stevens，1982）、凝集素組化反應（Apichela等，2010）。使用配備了QICam數碼相機并采用NIS軟件操作系統的Zeiss Axioskop顯微鏡進行普通光和熒光顯微鏡鏡檢。

1.3 凝集素組化反應

表1列出了本研究使用的凝集素、凝集素結合的碳水化合物成分、熒光結合物、濃度和各自相應的碳水化合物抑制劑。利用處理好的每組切片準備兩個陰性對照：一個切片孵育時不加凝集素，以證明自顯熒光細胞；另一切片加入凝集素以及其抑制糖，孵育時間至少40 min。

凝集素標記根據Apichela等（2010）的方法并略作修改進行；簡言之，切片脫蠟（二甲苯中洗滌兩次，每次10 min）后，在一組濃度呈梯度下降的酒精中（100%乙醇，2次×5 min/次；95%乙醇，1次×2 min/次；70%乙醇，1次×2 min/次）進行再水化，然后在去離子水中洗滌多次以除去過量的乙醇。之后在10 mM的Tris-HCl緩沖鹽水（pH 7.4）中孵育10 min，如有必要補充含有0.1 mM CaCl2、0.1 mM MnCl2、0.01 mM MgCl2或者 0.1 mM ZnCl2的TBS+（表1）。

TBS+組織隨后在優化的濃度中（表1）使用單種凝集素進行標記，時間為35 min～ 60 min；切片用TBS液洗滌3次，每次10 min，然后使用去離子水再洗滌3 min，以除去多余的鹽分。對于雙重凝集素標記實驗，此步驟重復一次。蓋玻片用Prolong Gold封固劑固定。熒光結合凝集素標記開始后，切片避光保存。

切片會在室溫下黑暗環境中儲存24 h，使封固劑凝固；隨后蓋玻片的邊緣使用指甲油將其密封起來，使切片能在4 ℃環境下長時間儲存以便于觀察和成像。切片成像在標記后1周內完成。之后切片可用Zeiss Axioskop顯微鏡觀察，也可以用激光掃描共聚焦顯微鏡進行觀察，該顯微鏡使用的是一種具有Zen 2012 64位圖像采集和處理軟件的Axio觀測器LMS 780。

凝集素標記的強度評分分為陰性（-）即不顯熒光、（+/-）即同類細胞顯熒光不一致、陽性（+）即熒光明顯，以及（++）即熒光明亮且一致。

2 結果

雖然UVJ的表面上皮細胞是由柱狀分泌細胞和纖毛細胞組成的假復層，但起源于UVJ表面上皮細胞管狀內陷的SST卻是由非分泌、無纖毛的柱狀上皮細胞組成。

包圍SST和下層UVJ上皮細胞的疏松結締組織含有多種類型的細胞和結締組織纖維（圖1a和1b）。該SST主要位于黏膜皺襞的上部，但偶爾也可在連接相鄰的褶皺的基底黏膜處觀察到（圖1b）。該SST中的精子群集——精子密集聚合地擠成一群群，幾乎按與SST長軸平行的方向排列，且頭朝SST的基部——在被檢測母雞偶爾可觀察到（圖1a）。

表2列出了凝集素與排列在UVJ和SST中的上皮細胞的結合親和力。因為在SST中觀察到相對較少的精子，精子-凝集素的結合親和力在本研究沒有探討。凝集素結合模式在未產蛋母雞、授精的青年母雞和老齡雞之間沒有明顯差異，只是在高受精率和低受精率的母雞之間觀察到雞冠刺桐凝集素（Erythrina Cristagalli，ECL）結合方式存在細微差別（表1，下文將討論）。

有證據表明，凝集素與這2種上皮細胞頂端表面的結合方式有差異。用GSL-II和WGA鑒定出含有復合糖的N-乙酰葡糖胺，二者有著幾乎相同的結合特性。WGA對UVJ和SST的上皮頂端表面都有很強的結合能力 （圖1a和圖2a～2d） 。

自上而下觀察SST內腔的頂端面，WGA似乎表現出能特異性結合SST頂端微絨毛 （圖2b）。GSL-II僅限于結合SST上皮細胞細胞質，并斷斷續續地結合SST頂端表面和UVJ上皮細胞的細胞質（圖2c）。

半乳糖和N-乙酰半乳糖胺中是否有復合糖的證據在檢測的6個凝集素試驗中不一致（表2）；另外，在一定程度上，在高受精率和低受精率的母雞間也不一致。WFA結合SST上皮細胞的方式與WGA的結合方式大致相同，不過與WGA比較，SST微絨毛并不能一致地與WFA結合，且結合的強度也不及WGA（圖3a～3c）。

ECL（圖3d）和大豆中的凝集素（Soybean，SBA）（圖2c和2d）對SST上皮細胞頂端面的結合既有陰性的也有陽性的，這表明不同SST上皮細胞對半乳糖和N-乙酰半乳糖胺成分的表達存在差異。像LTL一樣，WBA-I能結合到UVJ上皮細胞的頂端及基底膜（程度較小），但卻不能與SST上皮細胞結合。在高受精率或低受精率母雞的SST上皮細胞結合模式上，只有ECL表現出輕微且可檢測到的差別。

在高受精率的母雞中，ECL斷斷續續地與SST微絨毛結合：一些SST上皮細胞帶有強熒光，一些是陰性的（圖3d）。在低受精率母雞中，ECL不與SST微絨毛結合；另外，無論是高受精率還是低受精率的母雞，ECL都不能與它們的UVJ上皮細胞頂端面結合。

含復合糖的甘露糖用Con-A進行鑒定（表2）；疏松結締組織及SST黏膜下層細胞中的甘露糖大部分表現為一致的陽性。在檢測的這二種上皮細胞中，Con-A的結合不一致或呈陽性；當進行雙重染色時，Con-A的結合產生與其他凝集素（圖3a、3b和3d）不同的背景。含N-乙酰神經氨酸部分的復合糖用SNA定位（表2）。

SNA分布在整個UVJ上皮細胞中；但沒有分布在SST上皮細胞的側向細胞膜上，且緊密地結合在SST頂端的微絨毛上。雖然蓮花豆凝集素（Lotus Tetragonolobus，LTL）（巖藻糖親和力）定位在UVJ上皮細胞的纖毛上，然而LTL既不與SST上皮細胞的頂端面及細胞質結合，也不與SST上皮細胞的側面和基底膜結合（表2）。

3 討論

本研究鑒定了與UVJ和SST上皮細胞復合糖有關的細胞內和細胞外碳水化合物成分；觀測了凝集素與這兩種上皮細胞的結合模式之間的差異。然而，凝集素在與未產蛋母雞與授精的青年母雞、老齡母雞的這二種上皮細胞的結合模式上不存在差異；僅ECL與高受精率和低受精率母雞的SST上皮結合模式上有微小的差異。WFA和ECL與相互毗鄰的SST上皮細胞頂面的結合模式存在差異，這表明SST上皮細胞并不能一致地合成對這些凝集素有特異性的復合糖和碳水化合物成分。

ECL、SBA和WFL三種凝集素與含有半乳糖和N-乙酰半乳糖胺成分的碳水化合物結構的親和力及WGA一種凝集素與含有N-乙酰氨基葡萄糖成分的碳水化合物結構的親和力，都與SST頂端微絨毛密切相關。對N-乙酰神經氨酸有特異性的SNA表現為與SST頂面有很小的結合力。這一結果間接地支持了Steele和Wishart（1996）的觀測結果，他們將雞的精子與神經氨酸苷酶一起孵育，然后將神經氨酸苷酶處理過的精子輸入母雞體內，結果發現SST內幾乎沒有精子。

然而，當把這些用神經氨酸苷酶處理過的精子與UVJ-SST組織塊在體外一起孵育時，卻在SST中觀察到了精子。因此，可以認為精子質膜表層上的復合糖，其所含的終端神經氨酸對精子與SST上皮細胞頂端微絨毛的結合上并不是必需的。

在一個類似的研究中，研究人員計劃利用酶切方法切除雞和火雞精子質膜中的半乳糖和N-乙酰半乳糖胺，然后人工授精，并同時與含有SST的UVJ黏膜共同孵育。該研究將能夠證明精子上的這些碳水化合物在其與SST上皮細胞結合并維持母雞受精上的作用。半乳糖和N-乙酰半乳糖胺已被證實在駱駝（Apichela等，2010）和豬（Talevi和Gualtieri，2010）中參與精子與排列在峽部的上皮細胞的結合。

目前對SST上皮細胞與居留其中的精子之間細胞與分子的互作機制還很不清楚。盡管Ahammad等（2010）認為雞精子在通過雄性生殖系統時，在經過了一種特異的配體—受體相互作用后能夠與SST上皮細胞結合，這種與精子儲存和維持活力有關的結合其意義也僅僅是推測。

如與小鼠上獲得的結果（Fazeli等，2004）一樣，精子結合到SST上皮細胞有可能會開啟信號傳導通路，這種通路能修改SST上皮細胞的基因表達。本實驗室正在對這種可能性進行研究，我們正在解析從未產蛋母雞、高受精率及低受精率的肉種雞中分離SST上皮細胞的轉錄譜信息。

Bakst（1992）報道，在UVJ黏膜的壓片制備中，精子束內的精子表現出一種同步、緩慢、起伏的運動，而分散在SST管腔中的精子沒有這種現象。這種能夠使數以百計的精子同步起伏的信號機制尚不清楚。

Tingari和Lake（1973）報道，在精子束中，覆蓋在相鄰且并行的精子頭部的質膜似乎是黏著的；他們稱之為精子凝集反應。Schuppin等（1984）同樣用這一術語來描述火雞精子束中相鄰精子并列的質膜。然而，這種術語會誤導人們，因為到目前為止還沒有證據表明這是一種基于免疫的精子凝集反應，而僅僅是精子細胞膜緊密并排行為罷了。

最近，Bakst和Bauchan（2015）觀察發現，在火雞SST內的精子束中，除了在這兩塊質膜緊密并列的區域中外，覆蓋在核和中段上的精子質膜呈褶狀起狀。雖然不像是細胞接合，但是鄰近精子間緊密并列的質膜可能在精子-精子的通信上發揮一定的作用，特別是在使精子束中的精子以同步并行排列的方式緩慢起伏的移動上發揮一定的作用。

存在一種可能性，即精子通過糖配體與SST微絨毛結合，這可能幾乎對延長精子在輸卵管中的儲存能力沒有作用。與哺乳動物的每個精子都結合到峽部上皮細胞不同，位于雞精子束中心的精子似乎與SST上皮細胞沒有直接接觸。考慮到估計392個雞精子在SST中包裝成的一個精子束（Zavaleta和Ogasawara，1987），那么很明顯只有那些毗鄰SST上皮細胞的精子才可能與SST結合和交流。

Froman（2003）提出了一個描述精子儲存在SST中以及從SST中釋放的模型，該模型僅與精子的運動能力有關，并不涉及到精子與SST上皮細胞的直接交流。簡單地說，按照Froman模型，只要精子向上游動的速度可以大到足以抵抗從SST底部向其開口處產生的液體流，精子就可以進入SST且停留在其中。如果精子游動速度低于從SST中的液體流向UVJ腔流動的速度，精子就會被沖出SST。

盡管有關精子儲存的Froman模型沒有包括精子與SST上皮結合的作用，但它可以解釋精子束形成及隨后精子在SST中分散的現象。如Froman（2003）所說，精子利用其移動速度快于流出SST的液體流的速度來進入SST。

這里我們可以認為，這些精子在聚集到SST管腔底部前會穿過SST；精子會繼續沿SST長軸方向并行排列，同時頭部朝向SST管底部，形成一個緩慢起伏的精子束。該精子束一直保持著，直到單個精子的游動速度低于通過SST管腔的液體流的速度為止。這些移動速度較低的精子逐漸從精束中脫離，并分散到SST中或從SST排出。如果精子接受了來自UVJ上皮細胞的信號，那么它可能通過來自由SST上皮細胞頂端產生并釋放出來的SST上皮細胞或微絨毛泡的液體（Bakst和Bauchard，2014）。

綜上，本文研究了與SST上皮細胞頂面復合糖相關的半乳糖和N-乙酰半乳糖胺成分。這些復合糖或其他尚需鑒定的SST上皮細胞表面的復合糖是否在精子進入SST并從中釋放出來發揮了一定的作用，目前正在研究。