MMP21 MMP28與胃癌進展及不良預后的相關性研究

顏文輝 馬杰

MMP21 MMP28與胃癌進展及不良預后的相關性研究

顏文輝 馬杰

目的觀察人胃癌組織MMP21和MMP28的表達，探討其與臨床病理特征和預后的關系。方法應用免疫組化法檢測436例胃癌組織和92例癌旁胃組織MMP21和MMP28的表達，分析其與胃癌進展及不良預后的相關性。結果在胃癌組織中，MMP21、MMP28的陽性檢出率分別為31.9%（139/436）和34.4%（150/436）；而92例癌旁胃組織中，MMP21、MMP28均為陰性。在胃癌組織中，MMP21和MMP28的陽性表達與腫瘤大小、浸潤深度、血管侵襲、淋巴結、遠處轉移及TNM分期相關。總生存率在陽性患者比陰性患者低。Cox多因素分析表明在胃癌患者中MMP21、MMP28是生存的獨立預測因素。結論MMP21、MMP28與胃癌的侵襲、轉移和預后密切相關，其可能成為新的、獨立的預后指標。

MMP21 MMP28 胃癌 TMA 腫瘤進展 預后

胃癌是全世界最常見腫瘤之一，在所有癌癥病死率排名中位居第二，尤其在東亞和中國。因此，闡明胃癌病理機制并探尋有價值的預后指標和新的治療策略意義重大。人基質金屬蛋白酶（MMPs）包括膠原酶型（MMP-1，-8和-13），明膠酶型（MMP-2和-9），間質溶解素型（MMP-7和-26）和膜型基質金屬蛋白酶型（MMP-14，-15，-16，-17，-24和-25）以及其他基質金屬蛋白酶（MMP-19，-20，-21，-23和-28）。目前研究發現，在胃癌中，MMP-2，MMP-21，MMP-9，MMP-3，MMP-7和MMP-13的過表達與腫瘤侵襲性相關［1-3］。但MMP21和 MMP28在胃癌中表達情況和作用尚無詳細報道。本實驗研究胃癌中MMP21和MMP28的表達情況，并探討其臨床特征和胃癌總體生存率的相關性。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集2003年1月至2008年1月浙江省人民醫院胃癌組織標本436例及癌旁組織標本92例。男311，女125例；年齡17～91歲（平均年齡60歲），且術前未進行放化療。所有原發腫瘤標本的組織形態學均經蘇木精-伊紅染色病理組織鏡檢證實。性別、年齡、分化程度、淋巴結轉移和TNM分期臨床參數收集后制成資料庫（見表1）。從診斷到死亡或最后1次隨訪計算總生存期，通過電話訪問和問卷調查的形式，每3個月更新1次隨訪信息，死亡患者由家屬和備案材料證實，隨訪5年。本項目經浙江省人民醫院倫理委員會批準。

1.2 方法 通過免疫組化對正常胃黏膜和胃癌中MMP21、MMP28的表達進行評估。組織切片（4μm）經過二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水。切片浸入枸櫞酸抗原修復緩沖液進行高壓修復3min；每張切片加1滴3%H2O2，孵育15min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性；1%牛血清白蛋白孵育阻斷非特異性結合。切片沖洗，用兔抗MMP21單抗（PBS稀釋250倍；ab52817，Abcam，Cambridge，USA）和兔抗MMP28單抗（PBS稀釋250倍；ab155507，Abcam，Cambridge，USA）染色，4℃過夜。正常山羊血清作為陰性對照組。滴加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下孵育20min。最后，DAB顯色，切片用蘇木精復染。每張切片由2名病理科醫師分別計數，并進行免疫組化評估。通過觀察在光學顯微鏡下的平均信號強度（0～3等級）和陽性細胞百分比（0：＜5%；1：5%～25%；2：26%～50%；3：51%～75%；4：76%～100%）評估每張切片的免疫反應水平。積分為強度和陽性表達細胞數兩項記分之和：0～3分為陰性，4～12分為陽性［4］。

1.3 統計學方法 采用SPSS 11.0統計軟件。計數資料行χ2檢驗或Fisher檢驗。生存曲線用K-M法評估，并用log-rank檢驗計算曲線間的差異。使用Cox比例風險回歸模型進行多因素分析。使用Pearson相關分析方法估計蛋白質表達和臨床病理結果之間的相關性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床病理特征 436例胃癌患者，并根據WHO胃癌組織分類標準進行分類，其中乳頭狀腺瘤16例、管狀腺瘤326例、黏液腺瘤29例和印戒細胞癌65例。高分化13例、中分化128例、低分化293例、未分化2例。根據TNM分期標準、I期90例、II期104例、III期173例、IV期69例。血管侵犯253例、無血管侵犯183例。淋巴結轉移270例、無淋巴結轉移166例。遠處轉移61例、無遠處轉移375例。

2.2 MMP21、MMP28在胃癌中表達的臨床病理學 通過觀察436例患者標本中MMP21、MMP28陽性染色情況表明，黃棕色顆粒主要位于胃癌細胞胞漿，而在正常胃上皮細胞中染色陰性（見圖1、2）。胃黏膜固有層細胞中檢出的陽性染色為非特異性染色，不進行染色評估。在胃癌組織中，MMP21、MMP28的陽性檢出率分別為31.9%（139/436）和34.4%（150/436），而正常胃組織樣本中MMP21、MMP28染色均為陰性。Cox多因素分析表明在胃癌患者中TNM分期、Lauren分型及MMP21和MMP28表達為獨立預后因子。因此，在胃癌患者中MMP21和MMP28是生存的獨立預測因素。見表1、2。

表1 胃癌患者MMP21、MMP28表達陽性的相關因素［n（%）］

表2 Cox回歸分析

2.3 MMP21、MMP28過表達與預后不良相關 260例胃癌患者MMP21、MMP28表達陰性；113例MMP21、MMP28表達均陰性。MMP21、MMP28之間有明顯相關性（r=0.675，P＜0.001）。在436例胃癌患者中，MMP21陽性患者的中位生存時間較MMP21陰性患者明顯縮短［（27.95±1.19）個月：（50.42±0.86）個月，P＜0.001］；MMP21陽性患者5年生存率較MMP21陰性患者明顯縮短（7.9%，11/139：56.2%，167/297，P＜0.001）。同樣，MMP28陽性患者的中位生存時間較MMP21陰性患者明顯縮短［（29.06±1.27）個月：（50.73±0.85）個月，P＜0.001］；MMP28陽性患者5年生存率較MMP28陰性患者明顯縮短（9.3%，14/150：57.3%，164/286，P＜0.001）。在436例胃癌患者中，MMP21和MMP28均陽性患者的中位生存時間較陰性患者明顯縮短［（27.65±1.31）個月：（52.87±0.77）個月，P＜0.001］。

圖1 MMP21在胃癌組織芯片中的免疫組化表達

圖2 MMP21在胃癌組織芯片中的免疫組化表

3 討論

手術切除是進展期及轉移性胃癌最有效的治療方法，但約40%的患者在根治性術后復發。因此，在胃癌治療中，預測患者預后十分必要，故需找到一個更敏感的預后指標。

多種基質金屬蛋白酶（MMPs）在炎癥、黏膜創面愈合和腫瘤研究中有被報道。MMP28（上皮水解素）和MMP21是目前最新被克隆的人體基質金屬蛋白酶，在腫瘤進展中發揮重要的作用。MMP21是一種分子量為57kD的具有蛋白轉化酶活性的MMP。不同于其他包含10個外顯子的MMP基因，MMP21基因只包含7個外顯子。MMP21在人體多種惡性腫瘤如Merkel細胞癌、胰腺癌、結腸癌、乳腺癌、鱗狀上皮細胞癌和肝癌細胞中廣泛表達［5-10］。MMP28是一種分子量為59 kD的蛋白，包含一個信號肽序列、前肽區、鋅離子結合催化活性區及C末端血紅素結合蛋白樣域。研究發現，在皮膚基底層、睪丸和肺中，MMP28 mRNA水平最高；在口腔鱗狀細胞癌和食管癌細胞中，MMP28表達下調會導致錨著獨立性生長能力下降［11］。也有證據表明，通過激活TGF-β可誘導肺癌上皮間質轉化（EMT）［12］。

據報道，許多轉錄因子能與MMP21的啟動子區序列結合，例如Sp-1、Tcf-4、Pax、Notch、維甲酸受體結合位點、Smad3及AP-1 recognition motifs［13］。啟動子區包含一個保守GT盒，能與Sp1/Sp3蛋白（特異性蛋白1、3）結合，這在基因的基礎表達中必不可少。這些轉錄因子和GT盒參與許多調控細胞的生長、周期及腫瘤進展的基因表達。與其他主要表達于基質細胞的基質金屬蛋白酶不同，MMP21的表達主要局限于上皮細胞和腫瘤細胞，這表明，在癌癥進展中，MMP21具有多種調節細胞的功能。因此，探討MMP21在胃癌中的表達及預后價值是有意義的。

本資料中，MMP21和MMP28表達水平升高，其檢出率分別為31.9%和34.4%。MMP21和MMP28的高表達與腫瘤浸潤程度、淋巴結轉移數、血管侵犯和遠處轉移有關，這表明MMP21和MMP28參與細胞外基質的分解，在胃癌侵襲和轉移中扮演重要角色。從I期～IV期胃癌，MMP21和MMP28表達逐漸增高，這也表明MMP21和MMP28在胃癌進展中發揮重要作用。而兩者與性別、年齡、lauren分型、組織類型、分化程度無關。更重要的是，K-M生存分析顯示MMP21高表達的患者總生存期更低；MMP21和MMP28陽性患者比雙陰性或單陰性患者的中位生存時間明顯縮短。Cox回歸分析表明，在436例胃癌患者中，Lauren分型、TNM分期及MMP21的表達為獨立預后因素。其機制可能與細胞外基質的降解能力及轉錄因子調節MMP21和來誘導上皮間質轉化（EMT）有關—降解IV、V、VII、IX和X型變性膠原或調節細胞生長、細胞周期、腫瘤進展。

這些數據表明，MMP21和MMP28的表達與不良預后有關，且為獨立預后因素。其有望成為胃癌TNM分期系統外的另一個有用的預后指標，并可能通過此指標識別有可能復發和轉移的患者，判斷是否需要積極輔助化療。

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ObjectiveTo observe the expression of MMP21 and MMP28 in gastric cancer tissues，and explore their relationship with clinical pathological feature and prognosis.MethodsThe expression was detected by immunohistochemical in 436 cases of gastric carcinoma and 92 cases of adjacent gastric tissue with MMP21 and MMP28，and we analyzed their correlation with the progression and poor prognosis of gastric cancer.ResultsThe positive rate of MMP21 and MMP28 in gastric cancer tissues was 31.9%（139/436）and 34.4%（150/436）；but they were negative in 92 cases of adjacent normal gastric tissues. The positive expression of MMP21 and MMP28 related to tumor size，infi ltration depth，lymph vascular invasion，node metastasis and TNM staging. The total survival rate in positive patients lower than negative patients. Cox multivariate analysis showed that MMP21 and MMP2 were independent predictors of survival in patients with gastric cancer.ConclusionMMP21 and MMP28 closely contact with invasion，metastasis and prognosis，and they may become new and independent prognostic indicators in gastric cancer.

MMP21 MMP28 Gastric cancer TMA Tumour progression Prognosis

317500 浙江省溫嶺市中醫院病理科（顏文輝）

310014 浙江省人民醫院病理科（馬杰）