電壓依賴性鉀通道在京尼平苷調控大鼠胰島素分泌中的作用

劉云峰，丁亞琴，鐘向琴，任樂樂，白 濤，，劉萌萌，章 毅

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電壓依賴性鉀通道在京尼平苷調控大鼠胰島素分泌中的作用

劉云峰1，丁亞琴2，鐘向琴2，任樂樂2，白 濤1，2，劉萌萌2，章 毅2

目的 研究電壓依賴性鉀(Kv)通道在京尼平苷調控大鼠胰島素分泌機制中的作用。方法 采用放免法檢測大鼠胰島組織的胰島素分泌情況，膜片鉗技術記錄胰島β細胞Kv電流和動作電位時程(APD)。結果 在8.3 mmol/L葡萄糖條件下，京尼平苷(0～100 μmol/L)可劑量依賴性地增加胰島素分泌含量，在10 μmol/L時基本達最大促分泌效應，低糖(2.8 mmol/L)情況下則沒有作用。膜片鉗實驗數據表明，京尼平苷劑量依賴性地(0～100 μmol/L)降低Kv通道電流密度，并在10 μmol/L的濃度下發揮最大抑制作用，并明顯延長了動作電位時程。結論 京尼平苷在胰島β細胞中通過抑制Kv、延長APD發揮促胰島素分泌作用。

京尼平苷；胰島素分泌；電壓依賴性鉀通道；動作電位

隨著人類環境、飲食習慣等變化，糖尿病因其高發病率及高危害性在世界范圍內已成為一個日益嚴重的公共衛生問題。2013年一項流行病學調查顯示，中國成人糖尿病患病率已高達11.6%，約1.14億糖尿病病人[1]，研究能延緩或者治療糖尿病的藥物刻不容緩。臨床上使用的促胰島素分泌劑在長期用藥過程中易引發低血糖等不良反應[2]，因此研發具有葡萄糖依賴性的促胰島素分泌藥物對治療糖尿病有重要意義。京尼平苷(geniposide，GP)又名梔子苷，是一種環烯醚萜類化合物，主要存在于梔子、杜仲等植物中，具有抗炎、保肝[3]、抗糖尿病[4]等作用，近年來因其調節胰島素分泌作用被大家廣泛認識并加以研究。然而，京尼平苷調控胰島素分泌的機制仍然不明確，因此本課題將采用膜片鉗技術對電壓依刺性鉀(Kv)通道在調控胰島素分泌中所發揮的作用進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料及主要儀器 雄性Wistar大鼠(北京動物中心提供)，體重200 g～250 g。膠原酶 P(瑞士Roche)、BSA(加拿大BBI Life Science)、青鏈霉素(北京索萊寶公司)、Histopaque 1077(美國Sigma公司)、1640培養基(武漢博士德公司)、DispaseⅡ( 美國 Amresco)，大鼠胰島素放射免疫試劑盒(北京北方生物技術公司)；EPC 10 全自動膜片鉗(德國 HEKA)；細胞培養箱(北京博奧恒信生物科技有限公司)；臺式離心機(長沙湘儀儀器有限公司)；Narishige MODEL PP830 電極拉制儀、MIROFORGE MF830 拋光儀(日本 Narishige)。

1.2 方法

1.2.1 胰島、胰島細胞的分離及培養 大鼠處死，剪開腹部，暴露胰腺及膽管，從膽總管將1 mg/mL膠原酶P注入胰腺組織，水浴消化11 min，經Histopaque 1077梯度離心，體視顯微鏡下挑取分離純化后的胰島。分離所得胰島置于含10%胎牛血清，100 U/mL 青霉素，100 μg/mL 鏈霉素的1640培養基中，37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養[5]。胰島經DispaseⅡ消化可得到單個胰島細胞。

1.2.2 胰島素分泌實驗 配制KRBH孵育液，依實驗要求進行實驗分組，分別添加不同濃度的葡萄糖和京尼平苷，所有分組在藥物干預前用含2.8 mmol/L葡萄糖的KRBH液孵育30 min，然后依次加入不同濃度葡萄糖及藥物，培養箱中孵育30 min，收集上清，用放免法檢測胰島素分泌量。

1.2.3 膜片鉗技術 記錄Kv電流時，將細胞與電極形成穩定的GΩ封接，鉗制細胞于-70 mV，每10 mV一個步接，給予-70 mV～80 mV的電壓刺激，在全細胞模式下破膜，記錄400 ms內的電流變化。記錄動作電位時程(APD)時，細胞封接、破膜后，調為電流鉗模式，注入150 pA、4 ms的電流，計算從去極化開始到復極化至靜息電位上10 mV的電流時長。細胞電容大于7pF被認為是β細胞[6]。

2 結 果

2.1 京尼平苷對胰島素分泌的影響 在較低葡萄糖濃度(2.8 mmol/L)時，京尼平苷對胰島素分泌無明顯影響；在較高葡萄糖濃度(8.3 mmol/L)時，京尼平苷對胰島素分泌的調節呈濃度依賴性，且在10 μmol/L時基本達最大分泌量。詳見表1。

表1 不同濃度京尼平苷對 胰島素分泌的影響(±s) μIU/mL

2.2 京尼平苷對胰島β細胞Kv電流的影響 采用全細胞膜片鉗技術，檢測不同濃度的京尼平苷 (1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L) 對Kv電流的影響。本實驗所用細胞外液的葡萄糖濃度為11.1 mmol/L，可阻斷KATP通道的電流，排除了KATP對Kv電流的影響。在 80 mV電流刺激時，京尼平苷與對照組相比明顯地抑制了 Kv電流，且呈濃度依賴性。詳見表2。

表2 京尼平苷對電壓依賴性鉀通道的影響(±s)

2.3 Kv阻斷劑(TEA)對京尼平苷調節胰島素分泌的影響 Kv阻斷劑TEA可明顯抑制Kv電流。與2.8 mmol/L葡萄糖相比，8.3 mmol/L葡萄糖明顯促進了胰島素分泌(P<0.05)；在8.3 mmol/L葡萄糖條件下，給予京尼平苷和TEA均促進了胰島素分泌，與8.3 mmol/L葡萄糖相比，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表3、表4。

表3 TEA對Kv的抑制作用(±s)

表4 Kv阻斷劑對京尼平苷調節胰島素分泌的影響(±s)

2.4 京尼平苷對動作電位的影響 京尼平苷干預后與對照組相比，動作電位時程明顯延長(P<0.01)。詳見表5。

表5 京尼平苷對動作電位的影響(±s) ms

3 討 論

越來越多的證據表明：京尼平苷具有抗糖尿病的作用[7-8]。有報道稱，在鏈脲佐菌素(STZ)誘導的2型糖尿病(T2DM)大鼠模型中，京尼平苷可降低血糖濃度、提高外周胰島素水平、改善糖尿病大鼠胰島素抵抗的作用[9]。本研究證實：不同濃度的京尼平苷在低濃度葡萄糖(2.8 mmol/L)條件下對胰島素分泌無作用，而在8.3 mmol/L條件下可濃度依賴性的增加胰島素分泌量，且10 μmol/L時基本達最佳促泌效應。

在胰島β細胞中，阻斷Kv通道電流可延長動作電位進而產生促胰島素分泌的作用[10-11]。從膜片鉗所測結果可看出，隨著京尼平苷濃度的增加Kv電流呈逐漸抑制的趨勢，且在10 μmol/L時可基本達到最大抑制效果，而且本研究也表明京尼平苷顯著延長了動作電位時程。因此，認為京尼平苷通過阻斷Kv電流、延長動作電位，進而產生促胰島素分泌作用。TEA是常用的Kv阻斷劑。本實驗表明：TEA可極大地抑制Kv電流，在8.3 mmol/L葡萄糖條件下，TEA(20 mmol/L)可明顯促進胰島素分泌。然而，在同時使用TEA和京尼平苷孵育胰島時，其分泌量(9.22±0.89)高于單獨用TEA孵育所產生的胰島素分泌量(5.92±0.74)，即TEA并未完全減弱京尼平苷的促分泌作用。分析原因可能是京尼平苷調控胰島素分泌的過程不僅有電壓依賴性鉀通道參與，還有其他因素，諸如鈣離子通道等，對此將進一步深入地探索。

綜上所述，本研究證明京尼平苷在大鼠胰島β細胞中通過抑制Kv通道、延長動作電位時程發揮促胰島素分泌作用，即Kv通道在京尼平苷調控胰島素分泌作用中扮演重要角色，為深入理解京尼平苷抗糖尿病的機制提供了理論依據。

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(本文編輯郭懷印)

The Role of Voltage-dependent Potassium Channel in Geniposide-induced Insulin Secretion in Rats

Liu Yunfeng，Ding Yaqin，Zhong Xiangqin，Ren Lele，Bai Tao，Liu Mengmeng，Zhang Yi

The First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，Shanxi，China

Zhang Yi (Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，Shanxi，China)

Objective To explore the role of voltage-dependent potassium (Kv) channel in the mechanism of geniposide-induced insulin secretion in rats. Methods We evaluated the direct effects of geniposide on β-cell function using rat pancreatic islets and dispersed single cells. Patch β-clamp recordings were applied to measure Kv channels，action potential duration (APD). The level of insulin secretion and the content of cyclic AMP in the culture medium were measured with radioimmunoassay. Results Geniposide (0 to 100 μmol/L) potentiated insulin secretion from pancreatic islets in a dose-dependent manner under 8.3 mmol/L glucose conditions but not 2.8 mmol/L，and a maximal increase was observed when islets were exposed to geniposide at a concentration of 10 μmol/L. The current-voltage relationship curve obtained in patch-clamp experiments demonstrated that geniposide (0 to 100 μmol/L) dose-dependently decreased the current densities through Kv channels and exerted a maximal inhibitory effect at the concentration of 10 μmol/L.What’s more，we detected that geniposide significantly prolonged APD. Conclusion Geniposide can promote insulin secretion by inhibiting Kv and prolonging APD in islet β cells.

geniposide；insulin secretion；voltage-dependent potassium channel；action potential duration

國家自然科學基金(No.81273564，81373464，81670710)；山西省留學回國人員科技活動項目擇優資助(No.2016-97)

1.山西醫科大學第一醫院(太原030001)；2.山西醫科大學

章毅，E-mail：yizhang313@163.com

R335

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.22.011

1672-1349(2016)22-2626-03

2016-09-04)

引用信息：劉云峰，丁亞琴，鐘向琴，等.電壓依賴性鉀通道在京尼平苷調控大鼠胰島素分泌中的作用[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2016，14(22)：2626-2628.