微孔板式微生物法快速檢測乳粉中維生素B12含量

姚春華，洪 敏，胡克岐

（浙江公正檢驗中心有限公司浙江贊宇科技股份有限公司，浙江杭州 310009）

微孔板式微生物法快速檢測乳粉中維生素B12含量

姚春華，洪 敏，胡克岐

（浙江公正檢驗中心有限公司浙江贊宇科技股份有限公司，浙江杭州 310009）

采用博歐實德和拜發2種品牌的微孔板式微生物法定量檢測試劑盒，測定市售嬰幼兒配方乳粉中維生素B12含量，并進行對比。結果表明，在0.03～0.18μg·100g-1范圍內，博歐實德和拜發2種品牌試劑盒檢測維生素B12的標準曲線線性良好，檢測限為0.03μg·100g-1；重復性試驗相對標準偏差分別為4.6%～8.6%和2.9%～4.4%，加標回收率分別為82.5%～105.0%和90.2%～103.0%。2種品牌的試劑盒均能獲得較好效果，其中，拜發試劑盒重復性及準確度更佳。相較于傳統微生物檢測方法，微孔板式微生物法具有方便、快捷等特點，為食品質量控制工作提供一種耗時短、準確性好、靈敏度高的手段。

乳粉；微生物法；微孔板試劑盒；維生素B12

維生素B12（Cyanocobalamin，VB12）又稱氰鈷胺素，是一組由鈷結合咕啉環的紅色類咕啉化合物的總稱［1］，是維持人體正常代謝和機能不可缺少的一種微量營養素。人體每日所需的維生素B12為3μg左右，使用過量可引起過敏反應，甚至過敏性休克。若缺乏維生素B12，將影響人體對葉酸的利用，還可導致周圍神經炎和兒童貧血［2-3］。

目前，國內維生素B12檢測方法主要有液相色譜法［1］、酶聯免疫法［4］和微生物法［5-10］，其中，微生物法是經典的測定方法，它利用萊士曼氏乳酸桿菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis）對維生素B12的特異性和靈敏性，定量測定試樣中維生素B12的含量，在測定的特異性、靈敏度和結果準確性等方面是其他方法無法替代的。目前，我國現行的食品安全國家標準GB 5413.14—2010即是利用微生物法測定嬰幼兒食品和乳品中維生素B12。但該方法操作過程繁瑣，且對菌株活力、測試培養基的優劣、檢測所用器皿的清潔程度和試驗人員操作有較高要求。本試驗選用與國家標準原理相同的2種維生素B12測定試劑盒檢測嬰幼兒乳粉中維生素B12，通過對精密度、回收率等進行比較，建立一種方便、快捷的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

VersaMax型酶標儀，美谷分子儀器有限公司；BS224S型電子分析天平，賽多利斯科學儀器有限公司；580R型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；JB-CJ-2FC型超凈工作臺，蘇州佳寶凈化工程設備有限公司；GRP-9270型隔水式恒溫培養箱，上海森信實驗儀器有限公司；微量移液器（20～200μL，100～1000μL），德國Eppendorf公司；H111191型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司。

微孔板形式的微生物法定量檢測維生素B12試劑盒，德國拜發IFP公司；Biostest維生素B12（氰鈷胺素）檢測試劑盒，北京博歐實德生物技術有限公司；維生素B12標準物質，純度為98.4%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；樣品為市售嬰幼兒乳粉。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

稱取1 g均質樣品至50 m L無菌離心管中，加入40 m L蒸餾水，搖勻。95℃水浴中提取30 m in，其間振蕩至少5次，同時確保離心管塞緊閉。水浴結束后迅速冷卻至30℃以下，12 000 g離心10 min。根據樣品維生素B12標示濃度，取上清液在1.5 mL Eppendorf管中進一步稀釋。

1.2.2 標準溶液的制備

取出試劑盒中自帶的維生素B12標準品干粉，按照說明書要求加入相應體積的無菌水，充分搖勻后得到標準品原液。標準品濃縮液稀釋方法：取6支1.5 m L Eppendorf管，編號分別為1、2、3、4、5、6，分別加入標準品原液0、100、100、150、200、300μL，再分別加入無菌水900、900、400、350、300、200μL，制得終濃度分別為0、0.03、0.06、0.09、0.12、0.18μg·100 g-1的標準品梯度稀釋液，用于制作標準曲線。

1.2.3 測定培養基配制

取出試劑盒中維生素B12培養基，加入10 mL無菌水，蓋好培養基瓶，搖勻，95℃水浴5 min，其間振蕩至少2次，并確保瓶子密封。迅速冷卻至30℃以下，用0.2μm無菌濾膜過濾至15 m L無菌離心管中。

1.2.4 樣品測定

取出需要數量的微孔板條在板上固定，移取150μL維生素B12培養基至微孔中，然后移取150μL標準品或稀釋的樣品至微孔中，用黏合箔蓋住板條，于37℃黑暗條件下孵育48 h。孵育結束后，再次蓋緊黏合箔，將微孔板翻置在桌面上，在桌面平面上振蕩，使微生物均勻分布于培養基中，撕下黏合箔，清除微孔中液體表面的氣泡，用酶標儀于630 nm讀取各微孔吸光度，繪制標準曲線，計算樣品中維生素B12的含量。計算方法如下：

維生素B12（μg·100 g-1）=標準曲線計算的VB12含量（μg）×稀釋倍數/樣品質量（g）×100

2 結果與分析

2.1 繪制標準曲線

以維生素B12含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。標準曲線見圖1。2種試劑盒的標準曲線在0.03～0.18μg·100 g-1范圍內線性均良好，相關系數均在0.99以上。檢測限可達到0.03μg·100 g-1。

圖1 博歐實德（A）和拜發（B）的維生素B12標準曲線

2.2 重復性

選取4種不同品牌的奶粉，分別用2種試劑盒進行6次試驗，測試結果見表1，2種試劑盒檢測結果無統計學差異（P＞0.05）。博歐實德試劑盒和拜發試劑盒測定的4種不同奶粉維生素B12相對標準偏差分別為4.6%～8.6%和2.9%～4.4%，拜發試劑盒的重復性相對較好。

2.3 加標回收率

選取已知維生素B12含量的同一奶粉進行3個梯度的加標回收試驗，博歐實德試劑盒和拜發試劑盒測定的奶粉樣品中維生素B12加標回收率分別為82.5%～105.0%和90.2%～103.0%（表2），表明拜發試劑盒加標回收率較歐博實德試劑盒有更高的平均回收率且具有更小的離散變化。

表1 重復性試驗結果

表2 回收率試驗結果

3 小結與討論

運用微生物法檢測維生素B12，其準確度與靈敏度取決于實驗中乳酸菌接種數量、菌活力、培養基、樣品處理方式以及人員操作等因素。商品化的試劑盒雖然根據其工藝水平可以在一定程度上減小各孔細菌活力、培養基等造成的誤差，但是操作過程中仍需嚴格無菌操作，所用移液槍槍頭、離心管、過濾器等需提前滅菌，以避免外來微生物的污染；同時需要選擇適宜的稀釋倍數，吸光度值不宜過低或過高。

商業化試劑盒可以簡化操作步驟、縮短檢測所需的時間，為食品質量控制工作提供一種耗時短、準確性好、靈敏度高的手段。本研究分別采用博歐實德和拜發2種品牌的微孔板式試劑盒定量檢測市售嬰幼兒配方乳粉中維生素B12含量，這2種品牌試劑盒在0.03～0.18μg·100 g-1范圍內線性良好，相關系數分別為0.992和0.996；檢測限為0.03μg·100 g-1；重復性試驗中，樣品的平行性較好，相對標準偏差分別為4.6%～8.6%和2.9%～4.4%，加標回收率分別為82.5%～105.0%和90.2%～103.0%。2種品牌的試劑盒檢測嬰幼兒配方乳粉中維生素B12含量均能達到良好的效果，其中，拜發的試劑盒具有更好的重復性及準確度。

［1］ 郭松年，鞏澤龍，馮歆軼，等.超高效液相色譜串聯質譜法測定嬰兒奶粉中的維生素B12［J］.化學分析計量，2014，23（6）：8-10.

［2］ 郝巖平，姜金斗，房玉國.HPLC法測定嬰幼兒配方奶粉復合維生素添加劑中維生素B12方法的研究［J］.中國食品添加劑，2004（2）：93-96.

［3］ 儲小軍，陶保華，賴世云，等.固相萃取-二維液相色譜法測定嬰幼兒配方食品中的維生素B12［J］.浙江大學學報（農業與生命科學版），2013，39（2）：185-190.

［4］ 樂振竅，成立靜.ELISA法在功能飲料維生素B12測定中的應用［J］.飲料工業，2014，17（10）：30-33.

［5］ 中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會.食品安全國家標準：GB 5413.14—2010嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測定［S］.北京：中國標準出版社，2010.

［6］ 黃曉林，王淼，張麗宏，等.IFP微孔板試劑盒檢測配方乳粉中維生素B12方法探討［J］.中國乳品工業，2010，38（7）：48-49.

［7］ 吳環，劉冬虹，張慧，等.微生物法快速檢測食品中維生素B12含量的應用研究［J］.中國乳業，2014（4）：42-44.

［8］ 李全霞，崔亞娟，趙寅菲，等.微生物法測定食品中水溶性維生素的原理及進展［J］.食品科學，2013，34（13）：338-344.

［9］ 魯盛靜，田野.嬰幼兒食品和乳制品中維生素B12測定的探討［J］.中國乳品工業，2013，41（2）：50-52.

［10］ ESTEVE M J，FARRéR，FRíGOLA A，et al.Contents of vitamins B1，B2，B6，and B12in pork and meat products［J］. Meat Science，2002，62（1）：73-78.

（責任編輯：侯春曉）

TS207.3

：B

：0528-9017（2016）12-2096-03

文獻著錄格式：姚春華，洪敏，胡克岐.微孔板式微生物法快速檢測乳粉中維生素B12含量［J］.浙江農業科學，2016，57（12）：2096-2098.

10.16178/j.issn.0528-9017.20161255

2016-08-09

姚春華（1979—），女，浙江麗水人，工程師，碩士研究生，主要從事食品檢驗測試工作，E-mail：ych985@163.com。