APT5A1在大腸癌中的表達及意義

謝春英，徐雪松，楊照微，何成彥，黃麗紅，王 海，周勁松

(吉林大學中日聯誼醫院 檢驗科，吉林 長春130033)

APT5A1在大腸癌中的表達及意義

謝春英，徐雪松，楊照微，何成彥*，黃麗紅，王 海，周勁松

(吉林大學中日聯誼醫院 檢驗科，吉林 長春130033)

目的 探討APT5A1蛋白在大腸癌及癌旁組織的表達及其意義。方法 應用液質聯用技術對大腸癌及癌旁組織進行差異蛋白的分析檢測，并用免疫印跡驗證其準確性。結果 對差異蛋白點進行質譜鑒定，發現APT5A1蛋白在大腸癌組織中的表達水平低于癌旁組織，免疫印跡確認其準確性。結論 ATP5A1蛋白的低表達可能與大腸癌的癌變有密切的關系。

APT5A1蛋白；液質聯用技術；大腸癌

(ChinJLabDiagn,2016,20:1979)

大腸癌(CRC)是最常見的消化系統的腫瘤，已經成為全世界醫療保健的問題[1]。有專家預測，結直腸癌的發病率和死亡率在我國今后很長一段時間內將穩步上升，成為我國發病率上升最快的惡性腫瘤之一[2]。因其惡性程度高，容易發生淋巴道及血道轉移，就診時已經有15%-35%的患者發生轉移，喪失了手術治療的最佳時機[3],而早期無淋巴轉移者術后五年生存率卻可達90%[4]。所以大腸癌的早期治療能明顯改善患者的生存率，早發現、早診斷、早治療一直是大腸癌研究的熱點。大腸癌早期診斷指標的尋找及其發病機制的研究一直是國內外學者們關注的問題。外國學者研究發現ATP5A1基因與結直腸癌的發病有關，但主要是在基因水平上探討腫瘤發生的可能機制，而對ATP5A1蛋白質水平上的研究比較少，所以本研究采用蛋白質組學技術來探索ATP5A1蛋白在大腸癌及癌旁組織的表達情況。

1 材料與方法

1．1 組織來源

本實驗所用組織標本均經病理學檢查證實為大腸癌腺癌，癌旁組織標本均取自癌組織邊緣上端10 cm外處的正常組織，取材前患者未經任何治療。在上述標準下，收集吉林大學中日聯誼醫院經外科手術治療切除的大腸癌及配對的癌旁組織標本18例，生理鹽水即時沖洗干凈，放置-80℃冰箱保存備用。

1.2 主要試劑及儀器

二硫蘇糖醇(DTT),TMED,碘乙酰胺(IAA),十二烷基硫酸鈉(SDS)均購于美國GE公司，DNA酶，RNA酶，胰蛋白酶(測序級)，考馬斯亮藍-G250、苯甲基磺酰氟 (PMSF)購于美國Sigma公司，蛋白質定量試劑盒，尿素購自Bio-Rad公司，納升級毛細管高效液相色譜-電噴霧離子肼質譜儀為美國Thermo Fisher公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 提取組織蛋白及測定蛋白質濃度 取50 mg組織充分研磨制成勻漿，低溫離心留取上清備用。考馬斯亮藍染色,于595 nm處檢測蛋白吸光度，根據標準品蛋白含量及吸光度繪制標準曲線，分析組織中的蛋白質濃度。

1.3.2 組織蛋白水解制備多肽混合物 將提取的組織蛋白用一定濃度的NH4HCO3溶解稀釋，以降低組織蛋白中的尿素濃度。用DTT調定其終濃度至20 mmol/L,56℃避光放置1 h,還原蛋白質中被氧化失活的-SH基團。將反應體系降至室溫，加入1M的IAA混勻后調定其終濃度為50 mmol/L,避光反應30 min。按照1∶50(胰酶：蛋白質)的比例向反應體系中加入測序級的胰酶，37 ℃酶切水浴孵育過夜。酶切樣品分裝，-80 ℃保存備用。

1.3.3 二維色譜與質譜聯用鑒定蛋白質組成及數據庫檢索分析 用Buffer A溶液將樣品溶解，各取50 μg的樣品進行色譜上樣，樣品先進入低流速柱然后再經高流速柱進行洗脫。將洗脫的多肽用LTQXL離子肼質譜儀進行檢測，選擇合適的核質比檢測范圍，數據依賴方式二級全掃描。應用Thermo Fisher公司的Bioworks3.3.1SP1 軟件，使用SEQUEST算法在數據庫進行質譜數據的檢索，尋找與其匹配的蛋白質和多肽，從而鑒定出相關的差異蛋白。

1.3.4 免疫印跡確證試驗 對選定的目標蛋白ATP5A1進行免疫印跡試驗，進一步的驗證該蛋白的在大腸癌及癌旁組織的表達情況。ATP5A1單克隆抗體購自的美國Abgent公司，內參抗體為β-Actin。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 組織蛋白酶解產物的二維色譜與質譜聯用分析

本研究采用譜圖數來評價兩組樣品中同一個蛋白質的豐度，對于豐度發生變化的蛋白質，譜圖數需要滿足以下條件：(1)兩個樣品中譜圖數的比值大于等于1；(2)兩個樣品中譜圖數的差值大于等于72。通過具有統計學意義(每組至少做三次檢測)的比較分析，得到大腸癌與癌旁組織的差異蛋白44個，在癌組織中表達上調的蛋白質21個，下調蛋白23個，目標下調表達蛋白ATP5A1的質譜圖見圖1。

圖1 ATP5A1的質譜圖

2.2 免疫印跡驗證ATP5A1在大腸癌組織與癌旁組織的表達情況

用Western blot檢測大腸癌及癌旁組織中ATP5A1蛋白的表達情況。結果表明ATP5A1蛋白在大腸癌中的表達水平明顯低于配對的癌旁組織，此結果進一步的驗證了二維色譜與質譜聯用鑒定差異蛋白ATP5A1的準確性。結果見圖2。

圖2 ATP5A1的免疫印跡圖

3 討論

大腸癌的發生發展是一個復雜的生物學過程，在這一過程中必然伴隨著蛋白質的變化。蛋白質組學技術已經成為大腸癌研究中重要工具，可以高通量、大規模的分析腫瘤組織蛋白與正常組織蛋白，發現蛋白質在表達量上的差異，從而篩選出與腫瘤發生發展密切相關的蛋白質，而這種蛋白質則可能成為腫瘤早期診斷的新的生物學標志物[5]。

ATP5A1基因編碼ATP合酶的α-亞基，而ATP合酶則是位于線粒體上由16個蛋白質亞基組成的多亞基復合體，參與氧化磷酸化中ATP的合成和分解，而其α-亞基主要是參與質子的傳遞。ATP5A1基因位于人類的第18號染色體上，有研究證實該基因的失活會導致ATP合酶復合體的失活，從而促進細胞凋亡。Warburg假說認為，癌組織細胞由于線粒體功能受損，導致糖酵解的速率增加。之后該假說被不同類型的腫瘤證實了其正確性。有研究證實，在結腸癌中已經檢測到了ATP5A1的低表達，然而這種低表達可能有助于結腸癌細胞獲得對5-氟尿嘧啶的抵抗力[6]。而且ATP5A1基因的缺失與結直腸癌的低存活率相關，ATP5A1基因的低表達可能是臨床結直腸癌不良預后的一個生物標志[7]。根據大腸癌遺傳學發病機制將大腸癌分為兩類，染色體不穩定性型(CIN)和微衛星不穩定型(MSI)，ATP5A1基因在CIN中的表達水平高于MSI中的表達水平，而這種低表達的ATP5A1可能會促進MSI型腫瘤的發展[8]。所以ATP5A1蛋白的低表達可能對大腸癌腫瘤的分型和及預測患者的預后中會有一定的指向作用。

目前關于ATP5A1蛋白在惡性腫瘤中的研究不多，張景萍[9]等使用二維凝膠電泳和質譜聯用技術檢測到了ATP5A1蛋白在食管癌中的上調表達，

林河春[10]等使用iTRAQ技術發現ATP5A1在高轉移肺腺癌細胞中的表達水平低于低轉移的肺腺癌細胞，提示ATP5A1蛋白的低表達可能跟腫瘤的轉移有關，梁燕[11]等發現差異蛋白ATP5A1在鼻咽癌中也表達，可能成為鼻咽癌放射治療的靶點。盡管在不同的腫瘤中ATP5A1的表達情況有一定的差異，但都說明了ATP5A1蛋白在腫瘤的發生發展中有一定的提示作用。本研究采用液質聯用及蛋白質印跡技術闡明了ATP5A1蛋白在大腸癌及癌旁組織的表達情況，證實了癌旁組織中的表達的ATP5A1蛋白量明顯高于大腸癌組織，提示在癌變組織ATP5A1可能扮演了癌癥抑制因子的角色。由于蛋白質檢測的方便和穩定性，所以ATP5A1蛋白可能會成為大腸癌早期診斷的新的分子標志物，但是究竟能不能應用于臨床還需要進一步的研究。

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[3]增德妙，陳嘉勇.大腸癌轉移相關腫瘤標志物的研究進展[J].醫學綜述，2012,17(1)：88.

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[8]Seth R,Keeley J,Abu-Ali G,et al.The putative tumour modifier gene ATP5A1 is not mutated in human[J].J ClinPathol,2009 ,62(7):598.

[9]張景萍，李 卉，孫曉宏,等.ATP5a1基因在新疆哈薩克族食管癌中的表達分析[J].新疆醫科大學學報,2015,38(7):828.

[10]河 春,張方琳,耿 沁,等.應用iTRAQ技術篩選高轉移和低轉移肺腺癌細胞中差異表達的膜蛋白[J].腫瘤,2013,33(2):150.

[11]梁 燕，侯華新.大黃素乙酰化產物對鼻咽癌細胞放射增敏的線粒體蛋白靶點研究[D].碩士論文，廣西醫科大學，2012.

Expression and Significance of ATP5A1 in Colorectal Cancer

XIEChun-ying,XUEXue-song,YANGZhao-wei,etal.

(China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Objective To investigate the expression and significance of ATP5A1 in colorectal cancer tissue and tissue adjacent to carcinoma.Methods Two-dimensional chromatography and mass spectrometry method were applied to identifying the difference of protein expressed in colorectal cancer and carcinoma tissue adjacent,using western blot method to verify its accuracy.Results Dentifying the different protein spots,we found that ATP5A1 protein expressed significantly lower in colorectal cancer than that in the tissue adjacent to carcinoma,and then further confirmed its accuracy by western blot.Conclusion The decrease of ATP5A1 expression may be have a closely relationship with colorectal cancer.

APT5A1 ptotein;Two-dimensional chromatography and mass spectrometry;colorectal cancer

國家自然基金資助項目(81572082)；吉林省科技廳資助項目(2014041005GH，20140311092YY，20150101153，20150414015)

1007-4287(2016)12-1979-03

R735.3

A

2016-04-12)

*通訊作者