長鏈非編碼RNA與卒中的關系研究進展

芮陽剛，顏丙春

在人類基因組中，超過90%的基因被轉錄成核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），其中具有蛋白編碼功能的基因只有3%左右，大部分被轉錄成無蛋白編碼功能的非編碼RNA[1]。根據非編碼核糖核酸（noncoding RNA，ncRNA）長度，將ncRNA主要分為小非編碼RNA和長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）。lncRNA在轉錄水平調控基因表達，從而參與機體生理病理過程[2-3]。卒中是以腦部缺血及出血性損傷癥狀為主要臨床表現的疾病，以缺血性卒中最為常見。有研究發現，卒中可明顯改變大腦中信使RNA（mRNA）和ncRNA的表達，尤其在缺血性卒中方面，局部腦缺血后誘導大腦中一系列lncRNA表達模式的改變[4]，這提示lncRNA與卒中存在密切的關系，本文就lncRNA與卒中的相關研究作一綜述。

1 lncRNA概述

1.1 lncRNA定義 lncRNA是非編碼RNA分子中的一類，其轉錄本長度超過200 nt，在200 nt～100 kb之間，存在于胞漿內或細胞核內，普遍轉錄于真核細胞內且缺少蛋白編碼功能，其以RNA的形式在轉錄、轉錄后調控及表觀遺傳調控等層面調控基因的表達水平[5]。

1.2 lncRNA分類 根據目前的文獻，lncRNA有幾種不同的分類。從基因的角度可以將lncRNA分為5類：①同義；②反義；③雙向型，其表達起始位點與互補鏈上相鄰編碼轉錄物的表達起始位點在基因位點上距離十分相近；④內含子型，從另一個轉錄物內含子中得到的lncRNA；⑤基因間型，lncRNA作為獨立單元處于兩個基因之間。lncRNA在高等真核生物細胞中大量轉錄，許多已知的lncRNA由RNA聚合酶Ⅱ轉錄、可變剪切，并且常被多聚腺苷酸化。另一個分類包括高含量集中和低含量集中lncRNA，一些文獻按功能將其分為順式和反式[6-7]。

1.3 lncRNA作用機制 ①lncRNA可通過細胞周期調控、剪接調控、mRNA降解、基因印記、染色質重塑等形式參與轉錄水平、轉錄后水平和表觀遺傳水平調控生物學過程。許多lncRNA參與各種RNA-蛋白質以及亞細胞結構的形成，其作為支架分子發揮作用，依靠自身不同的效應分子結合結構域，為調控復合物提供一個平臺。②lncRNA調節蛋白質的活性和位點。作為引導分子指導RNA結合蛋白定位到特定的調控位點從而形成特定的空間結構。③lncRNA調節調節基因的表達。作為信號分子，傳遞生物發育的調控信號，調控相關基因的表達。④作為誘餌分子招募其他分子共同發揮生物學功能[8]。

2 lncRNA與卒中

卒中是由急性腦循環障礙所致的局部性或全面性腦功能缺損綜合征，是一種突然起病的腦血液循環障礙性疾病，又叫腦血管意外，是指腦血管疾病的患者，因各種誘發因素引起腦內動脈狹窄、閉塞或破裂，進而造成急性腦血液循環障礙，臨床上表現為一次性或永久性腦功能障礙的癥狀和體征。

2.1 實驗性蛛網膜下腔出血后早期腦損傷后lncRNA的表達特征 蛛網膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是卒中的一種類型，全世界范圍內，每10萬人中1～12人受到影響。越來越多的證據顯示，早期腦損傷是導致SAH患者死亡的主要原因之一[9]。ZHENG等[10]通過建立大鼠SAH模型，在其24 h后，用基因芯片檢測顳葉皮質中lncRNA及mRNA的表達譜，結果顯示，相對于對照組，在SAH模型組患者大腦中，有221個上調和181個下調mRNA基因（倍數變化＞2；P＜0.05），以及64個上調、144個下調lncRNA。其中，MRAK038897是變化的lncRNA中最顯著的（21.8倍數變化；P＜0.01）。MRAK038897與錨蛋白重復序列和細胞因子信號箱3的抑制相關，參與早期腦損傷（early brain injury，EBI）在神經元中的炎癥過程。因此，MRAK038897可能在EBI的調控中扮演一個重要的角色。為了驗證基因芯片的數據，兩個上調（BC092207、MRuc008hvl）和3個下調（XR_006756、MRAK038897和MRAK017168）的lncRNA被隨意選擇，通過定量反轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）進一步測定它們的表達水平。選定的lncRNA被證實其差異表達在SAH模型組與對照組比較中與基因芯片結果一致。BC092207和MRuc008hvl表達水平明顯上調，XR_006756、MRAK038897和MRAK017168顯著下調。以上結果表明，與對照組相比，SAH模型組患者lncRNA的表達水平有顯著差異，這表明lncRNA可能在蛛網膜下腔出血的病理生理過程扮演了重要角色。lncRNA以后可能成為蛛網膜下腔出血潛在的生物學指標和預后指標。

2.2 腦缺血后大腦微血管內皮細胞中lncRNA的改變 越來越多的證據顯示，缺血引起的大腦內皮損傷、內皮炎癥和隨后內皮功能的損害增加腦血管和血腦屏障的滲透，導致缺血性腦損傷[11-12]。在缺血性卒中條件下，對腦血管內皮細胞的保護，可以有效抑制或減少腦血管疾病，確立這種機制是很重要的。這種調節腦血管內皮細胞功能失調的介質有可能為卒中的治療提供新的靶點。ZHANG等[13]用RNA測序技術評測鼠在建立體外缺血性卒中且細胞缺氧缺糖（oxygen-glucose deprivation，OGD）后原發性腦微血管內皮細胞的lncRNA的表達特征。OGD 16 h后，10 677 lncRNA中有362個表達有顯著改變，包括147條上調和70條下調（倍數變化＞2）。其中，顯著上調的有Snhg12、Malat1和lnc-OGD 1006，顯著下調的有281008D09Rik、Peg13和lnc-OGD 3916。為了驗證RNA測序產生的表達譜，其又進行熒光定量RT-PCR，來確定兩者數據之間的關聯性。結果顯示，顯著上調或下調的腦內皮lncRNA與RNA測序技術評測相一致。此結果暗示在缺血的刺激下，這些lncRNA在調節腦血管內皮細胞方面擔當著功能性角色。

2.3 lncRNA FosDT（Fos downstream transcript）通過與相關染色質修飾蛋白的抑制因子相互作用促進缺血性腦損傷 缺血誘導腦內轉錄組廣泛改變從而影響卒中后神經功能的預后，除了蛋白編碼，許多ncRNA也在發生變化[4]。可是對于缺血后這些變化的意義是未知的，為填補這一空白，SHIMAZU等[14]分析了一個在成年老鼠短暫性大腦中動脈閉塞后出現的Fos下游轉錄物，他們將其稱作FosDT。為何選擇FosDT，他們給出了以下理由：①在局部腦缺血后急性階段可以明顯發現FosDT高度表達；②它與Fos基因屬于同類系，且在大腦損傷后Fos的快速誘導是細胞應激的標志物[15]；③它與卒中后誘導的沉默轉錄因子——染色質修飾蛋白Sin3a和coREST相結合。沉默轉錄因子在胚胎發育期間對細胞凋亡和分化起到至關重要的作用，并且參與成年大腦神經元的調節[16]。通過免疫印跡和RNA免疫蛋白結合沉淀技術等實驗得出相關分析結果。芯片顯示在短暫性大腦中動脈阻塞之后在再灌注3 h、6 h和12 h點FosDT表達明顯增加。再灌注12 h，RT-PCR結果顯示FosDT表達也顯著增加。用旋轉實驗、逃避試驗、移除黏附物能力測試測定老鼠從再灌注第1～7天內的運動功能障礙情況，結果顯示，與小的干涉RNA對照組相比，敲除FOSDT基因的老鼠運動功能的恢復較前者有明顯改善。而且，敲除FOSDT基因的老鼠大腦的梗死面積也得到減少。這些結果顯示，lncRNA可能成為治療卒中新的治療靶點[17]。

2.4 對新生鼠缺氧缺血性腦損傷（hypoxicischemic brain damage，HIBD）后lncRNA的表達網絡分析 HIBD仍然是引起新生兒發病和死亡的重要原因。在產科和新生兒護理中，新生兒缺氧缺血性腦病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）患者的生存率已有提高。但HIE依然對新生兒的健康和生活質量存在威脅[18]。ZHAO等[19]運用基因芯片、實時熒光定量PCR、RNA測序和捕獲測序等技術檢測缺血缺氧模型組合對照組老鼠大腦內的lncRNA。結果顯示，對照組與HIBD組的lncRNA有顯著的差異，在兩者之間一共找到322個表達有差異的lncRNA。其中BC088414是最明顯上調的lncRNA。另外，也有375個編碼基因存在差異。通路和基因本體論顯示上調的編碼基因主要涉及創傷、炎癥和防御，而下調的基因大部分與神經再生和修復相關。而且，非編碼共同表達網絡分析顯示BC088414與細胞凋亡相關基因Casp6和Adrb2有關。在PC12細胞中，BC088414的沉默引起Casp6和Adrb2基因mRNA水平的減少，減少細胞凋亡和促進細胞增生。這些結果提示lncRNA可能通過調節編碼基因參與HIBD的發病機制。

3 總結與展望

繼microRNA之后，ncRNA近年來逐漸成為研究的一大熱點。可是人們對哺乳動物細胞內非編碼RNA調控機制的了解還十分有限。但隨著人們對lncRNA的關注，越來越多的lncRNA進入人們的視野，lncRNA的異常表達涉及更多的疾病，在中樞神經系統中有許多特異性表達的lncRNA參與中樞神經系統生理和病理過程，這為人類揭示大腦的復雜性提供了方向，但研究的難度也隨之增加。在神經系統疾病中，對異常的lncRNA有待進一步探究，有必要對其表達分布、功能或其他水平上的分類進一步探索。lncRNA可能參與各類疾病生理病理的過程，尤其在腫瘤和神經疾病方面。未來必將有越來越多的lncRNA被發現與神經疾病尤其是卒中的關聯。因此，深入研究lncRNA與卒中的相關機制，有助于進一步闡明卒中的發生發展過程，為預防和治療卒中提供新的思路。

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