陽離子脂質體介導肽核酸轉染K562細胞的研究

王偲穎 林靖 韓媛媛 張華 黃盛文△

(1.貴州醫科大學附屬貴州省人民醫院檢驗科；2.貴州醫科大學附屬貴州省人民醫院輸血科，貴州 貴陽 550002)

·論 著·

陽離子脂質體介導肽核酸轉染K562細胞的研究

王偲穎1林靖2韓媛媛1張華1黃盛文1△

(1.貴州醫科大學附屬貴州省人民醫院檢驗科；2.貴州醫科大學附屬貴州省人民醫院輸血科，貴州 貴陽 550002)

目的 優化陽離子脂質體介導肽核酸(PNA)轉染K562細胞的條件。方法 以陽離子脂質體lipofectamine 2000為載體，將標記有FITC熒光基團的PNA轉染K562細胞，在熒光顯微鏡下觀察并計算其轉染效率，采用Cell Counting Kit(CCK-8)檢測其細胞毒性。應用正交試驗篩選出最佳的PNA和脂質體的用量及比例，并優化稀釋用培養基血清濃度，以獲得最優的轉染效果。結果 以2.5×105/mL～3×105/mL的細胞密度接種，100 μL/孔的培養基中加入PNA 6.25 pmol，PNA與脂質體的體積比為1∶3.5，稀釋用培養基未加胎牛血清時，細胞轉染效率和細胞毒性最佳，轉染效率為87.2%，細胞存活率(RGR)為94.1%。結論 PNA可通過陽離子脂質體轉染進入K562細胞，優化條件后得到的細胞轉染效率和細胞存活率能夠滿足基因表達研究的實驗要求。

K562細胞； 肽核酸； 脂質體轉染； 細胞毒性

β-地中海貧血(簡稱β地貧)是我國南方各省常見的常染色體隱性遺傳病，目前尚無有效的根治方法[1]。重新激活β地貧患者體內的γ-珠蛋白基因表達，提高HbF的合成量是治療這類疾病的重要策略[2]。PYR是一種SWI/SNF類染色質重組復合體，通過轉錄因子Ikaros與相應的DNA序列結合，其結合位點在δ-珠蛋白基因上游1 kb處一段250 bp長富含嘧啶堿基的序列。研究[3]表明，PYR與相應DNA序列結合在γ→β珠蛋白基因的轉換過程中起重要作用。我們設想與這一序列特異性結合的肽核酸(PNA)可有效阻斷γ→β珠蛋白基因的轉換，使γ-珠蛋白基因持續高表達。本研究以陽離子脂質體lipofectamine 2000為載體，介導特異性設計的PNA轉染K562細胞，通過優化轉染條件,以期待獲得相對較高的轉染效率和較低的細胞毒性，為進一步研究PNA對γ-珠蛋白基因表達的影響奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 K562細胞株購自中國科學院上海細胞生物學研究所；PNA由成都川抗派德生物技術有限公司合成；脂質體Lipofectamine 2000轉染試劑購自invitrogen公司；Cell Counting Kit(CCK-8)購自東仁化學科技(上海)有限公司；胎牛血清購自浙江天杭生物技術有限公司；改良型RPMI-1640培養基購自Hyclone公司；倒置顯微鏡OLYMPUS-IX51-FL(OLYMPUS公司)；熒光顯微鏡OLYMPUS-BX61(OLYMPUS公司)；酶標儀MULTISKAN FC型(Thermo公司)；細胞培養箱IGO150型(Thermo公司)。

1.2 PNA設計 本研究所設計的PNA序列為5’- TCCTTCTTCTCCTCCA，與PYR的DNA結合序列互補，用于阻斷γ→β珠蛋白基因開關。PNA的5’端標記有FITC熒光基團。

1.3 細胞培養 K562細胞用含10%胎牛血清的改良型1640培養基培養，培養液中青霉素和鏈霉素各100 U/mL,于37 ℃，體積分數為5%的CO2培養箱中，在飽和濕度條件下培養，在細胞匯合率90%左右可傳代或者進行轉染及細胞毒性實驗。

1.4 細胞轉染 按照3個因素3個水平(表1)設計正交試驗，共有9種不同條件的組合(F1～F9)，用于篩選細胞轉染的最佳的PNA和脂質體濃度及轉染時間。正交實驗的各實驗組，在轉染前將細胞用不含抗生素的改良型1640培養基洗滌重懸3次，用不含雙抗的含10%胎牛血清的改良型1640培養基培養2 d。然后以2.5×105～3×105個/mL的細胞密度接種于96孔板，100 μL/孔培養24 h。分別用25 μL的含10%胎牛血清的改良型1640培養基稀釋不同濃度的PNA和脂質體，3 min后將稀釋的PNA和脂質體混合并孵育25 min，再將50 μL的PNA脂質體混合物加入96孔板中，分別轉染24、36、48 h后在熒光顯微鏡下進行觀察和分析，每個條件組合做5個復孔。轉染成功細胞因帶有FITC熒光基團呈綠色，未轉染成功細胞呈藍色。轉染效率(%)=(綠色熒光細胞數/總細胞數)×100%。

表1 正交試驗的因素和水平

注：*體積比，PNA母液濃度為0.05 nmol/μL。

1.5 細胞轉染效率測定 轉染時間到后收集各組細胞懸液10 000r/min 離心2 min，棄掉多余上清只留取200 μL上清將離心的轉染細胞吹散打勻制成玻片在熒光顯微鏡(OLYMPUS-BX61)下觀察，在物鏡10×和目鏡15×放大倍數DAPI系統下拍照，綠色熒光下計數熒光細胞，紫外光下計數總細胞，綠色熒光陽性的細胞占細胞總數的百分比即為轉染效率，每次實驗隨機觀察4個視野取其平均值用于轉染效率的統計。

1.6 細胞毒性測定 細胞轉染時設置空白調零孔和對照組。空白調零孔即鋪板時不加細胞只加入100 μL培養基，在轉染時不加PNA和脂質體，只加入50 μL的1640培養基；對照組即在轉染時不加PNA和脂質體，只加入50 μL的1640培養基。到轉染時間后，每孔按10%反應體系體積的量加入CCK-8試劑，孵育合適時間[保證測試孔吸光度值(OD值)在0.8～1.5]后，用空白調零孔進行調零，用酶標儀在450 nm處測定每孔的OD值，并根據吸光度值計算其細胞抑制率以得出其RGR值。細胞抑制率=[(對照孔OD值-實驗孔OD值)/對照孔OD值]×100%，細胞存活率RGR=(1-細胞抑制率)。

1.7 稀釋用培養基血清濃度的優化 在轉染前將細胞用不含抗生素的1640培養基洗滌重懸3次，用不含雙抗的含10%胎牛血清的改良型1640培養基培養2 d。然后以2.5×105～3×105個/mL的細胞密度接種于96孔板，100 μL/孔培養24 h。分別用25 μL的含4種不同濃度胎牛血清(分別為0%、10%、20%和30%)的改良型1640培養基稀釋按正交實驗結果所得最佳的PNA和脂質體濃度組合，3 min后將稀釋的PNA和脂質體混合并孵育25 min，然后將50 μL的PNA脂質體混合物加入96孔板中，5 h后每孔加入50 μL胎牛血清。轉染48 h后測定其轉染效率和細胞毒性，篩選出轉染效率高且細胞毒性低的稀釋用培養基血清濃度。

1.8 統計學處理 正交表采用極差分析法計算分析，總結各因素對細胞轉染效率及細胞毒性的影響，篩選出轉染效率高且細胞毒性在20%以內的組合。

2 結 果

2.1 PNA和脂質體濃度及比例 PNA加入量越多，細胞轉染效率越高，但細胞毒性也隨之增大，轉染48 h的轉染效率最高(表2)。根據轉染效率和細胞毒性進行綜合判斷，最佳的條件組合為F5 (A2B2C3)，即PNA加入量為6.25 pmol/孔(PNA母液濃度為0.05 nmoL/μL)，脂質體量為0.437 5 μL，PNA與脂質體的體積比為1∶3.5，轉染時間為48 h。這一條件所得轉染效率為57.8%，細胞抑制率為19.7%。

表2 正交實驗結果

2.2 稀釋用培養基血清濃度的優化結果 以正交試驗所得最佳條件(A2B2C3)為基礎，不同血清濃度的培養基稀釋脂質體和PNA的細胞轉染結果見表3。由表3可以看出，4種稀釋脂質體和PNA的培養基中，不含胎牛血清的轉染效率最高且毒性最小，轉染效率為87.2%，細胞毒性5.9%，即RGR=94.1%。這一轉染條件的熒光顯微鏡下細胞見圖1。

表3 稀釋用培養基血清濃度優化結果

注：藍色細胞加綠色熒光細胞為總細胞數，藍色細胞為未轉染成功細胞，綠色熒光細胞為轉染成功細胞。圖1 熒光顯微鏡轉染細胞(10×15)

3 討 論

細胞轉染技術是研究特定的基因表達調控及基因治療的重要技術之一, 選擇合適的細胞轉染方法對提高細胞轉染率至關重要。陽離子脂質體屬于無反應活性的立體穩定脂質體，能夠轉運DNA、RNA、核糖體及其它大電荷分子和大分子等物質進入細胞，而且轉染效率也較高,因此被廣泛應用于各種細胞的轉染[4]。陽離子脂質體作為基因轉染載體的特點是載體與目的基因以靜電作用相結合,攜帶的外源基因容量較大,不含抗原成分,細胞毒性低,可被機體降解,可進行多次反復轉染,因此是一種有臨床應用潛力的基因轉染載體[5]。

肽核酸(PNA)是以肽骨架取代DNA中脫氧核糖磷酸酯骨架的DNA類似物，其主鏈骨架是由重復的N-(2-氨基乙基)甘氨酸殘基通過酰胺鍵連接而成，而堿基是通過亞甲基羰基連接到PNA分子的主鏈骨架上[6]。由于PNA生物性質穩定，不被核酸酶和蛋白酶消化降解，能以極高的序列特異性與DNA、RNA和PNA雜交形成極其穩定的二聚體或三聚體，已在基因診斷、基因治療、癌基因研究以及反義藥物等分子生物學領域有著廣泛的應用[7]。介導PNA進行細胞轉染的常見方法有磷酸鈣沉淀法、脂質體轉染法、電穿孔法、超聲靶向轉染法等，脂質體轉染由于其高轉染效率及低細胞毒性、易于優化操作等優點而在細胞轉染中得到廣泛應用[8-9]。基因轉染過程中影響因素很多，不同細胞類型或不同細胞系所需要考慮的因素也不一樣 ,在不同培養條件下的轉染方法也有一定的差異[5]。本研究通過正交實驗的方法探尋了轉染K562細胞時肽核酸、脂質體的用量、比例和轉染時間等因素。結果表明隨著PNA用量增多，轉染效率升高，但是細胞毒性也會隨之增大；PNA和脂質體體積比為1∶3.5時轉染效率和細胞毒性的綜合結果最好。

考慮到稀釋孵育PNA和脂質體過程中，用于稀釋的培養基血清濃度會影響到PNA脂質體復合物的形成[10]，為進一步提高轉染效率降低細胞毒性，本研究對轉染過程中的稀釋用的培養基血清濃度進行了優化，最后得出用不含胎牛血清的培養基稀釋孵育脂質體和PNA，在轉染5 h后再加入血清(此時加入血清并加大其用量的目的是為了給轉染細胞提供充足的營養，以降低其細胞毒性)，最終得到較為理想的轉染效率和細胞存活率(RGR)，轉染效率達到88.2%，RGR為94.1%,根據美國藥典細胞毒性分級：RGR在80%～100%為Ⅰ級細胞,能夠滿足下一步的科學研究。本研究經轉染條件的優化，與同類型文獻報道相比，本研究所得轉染效率要更高而細胞毒性則更小，所得轉染效率和RGR能夠滿足進一步研究PNA對γ-珠蛋白基因表達影響的實驗要求。

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Experimental study on peptide nucleic acid transfection into K562 cells mediated by cationic liposome

WangSiying1,LinJing2,HanYuanyuan1,ZhangHua1,HuangShengwen1.

1.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedGuizhouProvincialPeople'sHospital,GuizhouMedicialUniversity,Guiyang550002,China. 2.DepartmentofBloodTransfusion,AffiliatedGuizhouProvincialPeople'sHospital,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550002,China.

Objective Abstract Objective To optimize the transfection conditions for peptide nucleic acid (PNA) into K562 cells mediated by cationic liposome. Methods With the cationic liposome lipofectamine 2000 used as vector, PNAs marked by FITC fluorophore were transfected into K562 cells. Transfection efficiency was calculated according to the observation of cells under fluorescence microscope, and cytotoxicity was examined using Cell Counting Kit (CCK-8). In order to achieve the best transfection results, the dose and proportion of PNA and liposomes were optimized by orthogonal experiment, as well as the serum concentration in medium used as dilution was optimized. Results When the cells with the density of 2.5×105/mL-3×105/mL were cultured, the optimized transfection conditions were as follow: each 100 μl medium added with 6.25pmol PNA, the volume proportion of PNA to liposomes was 1∶3.5, and the medium used as dilution had no fetal bovine serum. Under these conditions, the best transfection results were achieved, with a transfection efficiency of 87.2% and a relative growth rate (RGR) of 94.1%. Conclusion PNA could be transfected into K562 cells mediated by cationic liposome. The cells transfection efficiency and RGR achieved under the optimized transfection conditions could satisfy the requirement of gene expression research.

K562 cell； Peptide nucleic acid； Liposome transfection； Cytotoxicity

貴州省優秀科技教育人才省長專項資金(黔省專合字201088號)

R394.3

A

1000-744X(2016)04-0341-03

2015-09-25)

△通信作者，E-mial:hsw713@sina.com