22q11.2微缺失在貴州少數民族先天性心臟病患者中的研究

龔啟華 楊一峰 趙天力 陳金蘭 李業濤

(1.貴州省人民醫院心臟外科,貴州 貴陽 550002；2.中南大學湘雅二院胸心外科,湖南 長沙 410011 )

22q11.2微缺失在貴州少數民族先天性心臟病患者中的研究

龔啟華1楊一峰2趙天力2陳金蘭2李業濤1

(1.貴州省人民醫院心臟外科,貴州 貴陽 550002；2.中南大學湘雅二院胸心外科,湖南 長沙 410011 )

目的 探索22q11.2微缺失在貴州少數民族先天性心臟病患者中的發病情況。方法 選取44例苗族、侗族及布依族先天性心臟病患者，在UCSC數據庫中選擇合適的BAC克隆，自制雙色BAC探針，采用雙色細菌人工染色體-熒光原位雜交技術對上述患者進行22q11.2微缺失檢測。結果 在2例法洛四聯癥患者中檢測到22q11.2微缺失，缺失率為4.5%(2/44)。結論 在苗族、布依族、侗族等少數民族先天性心臟病患者中存在22q11.2微缺失現象，對發現的陽性患者應密切觀察其行為和認知方面的發育情況，一旦發現異常，應予以積極干預。

少數民族； 雙色細菌人工染色體-熒光原位雜交； 22q11.2微缺失； 先天性心臟病

22q11.2微缺失綜合征是人類最常見的微缺失綜合征，約80%的22q11.2微缺失患者合并某種類型的先天性心臟畸形[1-3]。絕大部分22q11.2微缺失綜合征患兒存在學習困難、智力障礙程度不等的認知缺陷[4-5]，該微缺失綜合征患者患精神分裂癥的風險較普通人群明顯增加。全國苗族、布依族、侗族人口主要分布在貴州，目前國內外鮮有關于22q11.2微缺失在苗族、布依族、侗族等少數民族中發病情況的研究。因此，有必要對苗族、布依族、侗族等少數民族先天性心臟病患者22q11.2微缺失發病情況進行研究，以期從分子水平闡明先天性心臟病的發病機理；同時對發現的陽性患者在行為和認知方面給予科學的指導和建議,以提高該類患者的生活質量和社會適應能力。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇貴州省人民醫院心臟外科收治的44例苗族、侗族及布依族先天性心臟病患者，所有患者均經心臟彩色多普勒及手術確診。其中男22例，女22例；年齡7個月至53歲，平均(11.9±10.8)歲；苗族16例，侗族10例，布依族18例；所合并先天性心臟病包括：室間隔缺損16例，室間隔缺損合并房間隔缺損3例，室間隔缺損合并動脈導管未閉1例，室間隔缺損合并肺動脈瓣狹窄1例，室間隔缺損、主動脈瓣脫垂并返流1例，肺動脈瓣狹窄1例，房間隔缺損7例，動脈導管未閉2例，法洛四聯癥5例，部分型肺靜脈異位引流3例，主動脈竇瘤破裂、室間隔缺損并主動脈瓣返流1例，先天性主動脈瓣狹窄1例，先天性主動脈瓣狹窄并關閉不全1例，Ebstein畸形合并房間隔缺損1例。

1.2 方法

1.2.1 選擇BAC克隆 在UCSC數據庫中根據實驗需要選擇了2個BAC克隆，其中1個為經典缺失區域遠側克隆，另1個為位于缺失區域中克隆，分別標記不同的熒光顏色，所選BAC克隆及標記情況見表1。

表1 所選BAC克隆及標記情況

1.2.2 制片 將肝素抗凝的患者外周血接種于外周血淋巴細胞培養基內，37 ℃培養箱內懸浮培養72 h后進行收獲。調定細胞懸液濃度，用100 μL移液器吸10 μL滴片,稍干,將玻片依次放入70%、90%、100%乙醇中各2 min，保存于-20 ℃備用。

1.2.3 制備探針 無菌操作臺上，接種BAC菌種于含氯霉素(氯霉素終濃度為30 μg/mL)的固體LB平板中，37 ℃培養箱內培養過夜。從平板中挑取單個細菌克隆轉入含氯霉素(氯霉素終濃度為30 μg/mL)的5 mL液體LB培養液中，空氣搖床上37 ℃，300 rpm，振蕩培養12～16 h。DNA的分離提純采用QIAGEN公司的QIAGEN Large-Construct Kit抽提，具體操作按說明書進行。提純后用核酸測定儀測定所獲BAC-DNA的濃度(200～500 ng為宜)，采用缺口平移標記法標記探針(Nick Translation kit，vysis 公司)。取標記好的探針5 μL,運用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，探針片段在200～500 bp為宜。取標記好的探針45 μL，加入1 μL E．coli tRNA(5 μg/μL)、5 μL鮭魚精DNA(10 mg/mL)、6 μL 8M醋酸胺、1 μL糖元 (10 mg/mL)及200 μL無水乙醇，-70℃放置30 min，4 ℃ 15 000 rpm離心10 min，去上清，加入200 μL 70%乙醇，4 ℃ 15 000 rpm離心5 min，吸去乙醇，加入甲酰胺15 μL，室溫避光溶解20 min后-20 ℃保存。

1.2.4 熒光原位雜交 取7.5 μL已變性好的雜交液滴置已變性干燥的玻片雜交區，封片后置密閉濕盒中37 ℃雜交48 h。從培養箱中取出玻片，去除封片膠。將玻片置于已預溫至43 ℃的50% Formamide /2×SSC洗滌15 min、50% Formamide /2×SSC洗滌15 min、2×SSC洗滌5 min、1×SSC洗滌5 min、0.1%Triton X-100/4×SSC洗滌5 min、4×SSC 洗滌5 min、4×SSC洗滌5 min及2×SSC洗滌5 min，室溫下依次過70%、90%及100%乙醇各2 min，室溫下干燥后加DAPI 15 μL染色、蓋上蓋玻片。

1.2.5 觀察記錄結果 采用Leica DM5000B熒光顯微鏡對雜交片子進行觀察，并對雜交結果進行拍照保存。

2 結 果

44例患者中在2例法洛四聯癥患者檢測到22q11.2微缺失，總缺失檢出率為4.5%。見圖1。其余患者中未檢測到22q11.2微缺失存在。

注：綠色信號代表對照組探針，紅色信號代表實驗組探針。探針組合：CTD-2335H16(綠色)+RP11-316L10(紅色)；兩圖中綠色信號為2個，紅色信號均為1個，表示該2例患者均存在22q11.2微缺失。 圖1 a、b分別為2例22q11.2微缺失檢測陽性患者FISH檢查結果。

3 討 論

22q11.2微缺失綜合征臨床表現變異較大，包括心臟畸形、特殊面容、認知缺陷、精神疾病、行為異常、免疫缺陷、腭裂、甲狀旁腺缺如或發育不良等[6-12]。22q11.2微缺失綜合征被認為是除21-三體綜合征以外的引起先天性心臟畸形最常見的遺傳因素，其所合并的先天性心臟畸形是導致22q11.2微缺失綜合征患者早期死亡的主要原因，往往需要進行外科手術矯治。

在以往研究中先天性心臟病患者22q11.2微缺失綜合征的發病率差異較大。Agergaard 等[13]認為22q11.2微缺失綜合征在先天性心臟病患者中的發病情況與研究人群所患心臟畸形種類、年齡范圍及是否合并心外畸形等納入標準密切相關。在主動脈弓中斷、永存動脈干、肺動脈閉鎖合并室間隔缺損以及法洛四聯癥4種圓錐動脈干畸形中，22q11.2微缺失綜合征具有較高的發病率。但在房間隔缺損、室間隔缺損、左心發育不良綜合征及心室雙入口等非圓錐動脈干畸形中也存在合并22q11.2微缺失綜合征的報道，病理機制尚不明確[13-14]。在本組研究中，共在2例法洛四聯癥患者中發現存在22q11.2微缺失，發病率為4.5%(2/44),明顯低于上述研究;且在房間隔缺損、室間隔缺損等非圓錐動脈干畸形中未發現合并22q11.2微缺失。導致上述差異出現的原因考慮與以下因素有關：(1)由于本心臟中心所處地區的經濟社會原因，大部分較復雜的圓錐動脈干畸形患者未能就診接受手術治療，使本組研究中圓錐動脈干畸形患者病例數比例較上述研究偏低。(2)本組研究對象總樣本量偏小。在今后的研究中我們將擴大樣本量及所納入心臟畸形的范圍，更加準確地反映22q11.2微缺失綜合征在苗族、布依族、侗族等少數民族先天性心臟病患者中的發病情況。

絕大部分22q11.2微缺失綜合征患兒存在學習困難、智力障礙程度不等的認知缺陷[4-5]。22q11.2微缺失綜合征還與行為及精神異常密切相關，該類患者患精神分裂癥的風險較普通人群明顯增加。研究[15-16]發現, 大約22.6%～25%的22q11.2微缺失綜合征患兒在青少年期或成人期發展為精神分裂癥。本研究中，1例學齡患兒存在語言發育遲緩，已向患者家屬推薦進行干預治療。由于本組研究對象年齡偏小、隨訪時間偏短，暫未發現精神異常情況的發生，但隨著患兒的成長及隨訪時間的延長，有可能將面臨這一問題。我們已對接受隨訪的患兒家屬進行宣教，以期早期發現患兒成長過程中的精神異常情況，并及時予以治療。

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Study on 22q11.2 microdeletion in patients with congenital heart disease in the minority in Guizhou province.

GongQihua1,YangYifeng2,ZhaoTianli2,ChenJinlan2,LiYetao1.

1.DepartmentofCardiacSurgery,theGuizhouProvincialpeople'sHospital, 550002,P.R.China. 2.DepartmentofThoracicandCardiovascularSurgery,SecondXiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410011,China.

Objective To determine the frequency of 22qll.2 microdeletions in patients with congenital heart disease in the Miao, Dong and Buyi minorities in Guizhou province. Methods A total of 44 patients with congenital heart disease，22 female and 22 male , ranging in age from 0.58 to 53 years, were included in our study. The dural-color bacterial artificial chromosome (BAC) fluorescence in situ hybridization with RP11-316L10/CTD-2335H16 probe was used to find the chromosome 22qll.2 deletion in peripheral blood cells of patients.Results Chromosome 22qll.2 microdeletion was detected in 2(2/44) patients with tetralogy of fallot. The total frequency of 22qll.2 deletion was 4.5%. Conclusion There is 22qll.2 microdeletion in Miao, Dong and Buyi minorities.

Minority； Dural-color bacterial artificial chromosome fluorescence in situ hybridization； 22q11.2 microdeletion； Congenital heart disease

貴州省科學技術基金[黔科合J字(2009)2317]

R654.2

A

1002-6975(2016)04-0351-03

2015-09-12)