蘆丁對大鼠腦缺血性再灌注損傷的保護作用

張俊 孔德斌 蔡云鵬 李建華

(烏魯木齊市生產建設兵團醫院神經外科，新疆 烏魯木齊 830063)

蘆丁對大鼠腦缺血性再灌注損傷的保護作用

張俊 孔德斌 蔡云鵬 李建華

(烏魯木齊市生產建設兵團醫院神經外科，新疆 烏魯木齊 830063)

目的 探討蘆丁對腦缺血再灌注損傷的作用及機制。方法 30只SD 大鼠隨機分為3組。模型組和蘆丁組采用線栓法構建大腦中動脈局灶缺血(1.5 h)再灌注損傷模型，蘆丁組在缺血前 15 min腹腔注射蘆丁(10 mg /kg)， 模型組腹腔注射等量生理鹽水。術后 24 h處死大鼠，收集腦組織和血清，HE染色觀察腦組織病理形態學變化，ELISA檢測和RT-PCR檢測腦組織促炎癥細胞因子TNF-α，IL-1β 和IL-8的表達變化， Western Blot檢測腦組織中Wnt，β-catenin，cyclin D 1 和 survivin 的表達變化。結果 蘆丁可減輕腦缺血再灌注損傷大鼠的腦組織病理形態學變化， Wnt和β-catenin的表達和促炎癥細胞因子TNF-α， IL-1β和IL-8表達(P< 0.05)。結論 蘆丁可通過抑制Wnt/β-catenin信號途徑介導的炎性反應而減輕腦缺血再灌注損傷。

蘆丁; 腦缺血再灌注損傷; 促炎癥細胞因子; Wnt/β-catenin

腦缺血性卒中是導致人群致死和致殘的重要原因，僅次于心臟疾病和癌癥。而腦缺血再灌注損傷是導致腦缺血性卒中的重要病理過程，因此減輕腦缺血再灌注損傷具有重要的臨床意義[1-2]。蘆丁是一種從水果，蔬菜和植物中提取的黃酮類物質，研究[3-4]發現其具有抗炎功效，而炎癥是導致腦缺血再灌注損傷的重要原因[5-6]。因此本實驗以大鼠為研究對象，探討蘆丁對腦缺血再灌注損傷的作用及其機制?，F報告如下。

1 資料與方法

1.1 動物 雄性SD 大鼠 30 只，體質量(220 ± 20)g，合格證號 SCXK(京)2010-20149， 由北京華?？祵嶒瀯游镏行奶峁?。均提前 2 周購入，放置在SPF動物飼養室內喂養。

1.2 藥物及試劑 白介素-6 ( IL-6) , 腫瘤壞死因子-α( TNF-α)、 白介素-8 ( IL-8)， ELISA檢測盒(Ebioscience, USA)，蘆丁注射液(哈森，中國)，Wnt(CST, USA), β-catenin (CST, USA)，cyclin D 1(CST, USA) ，survivin(CST, USA),β-actin (abgent，USA), HE染色劑、顯微鏡(Olympus BX51)及成像系統(HITMAS-30)顯微鏡( Olympus BX51) 及成像系統(HITMAS-30)均為醫院病理科實驗室臨床病理組提供。

1.3 實驗動物的分組和腦缺血再灌注損傷動物模型的構建 30只SD大鼠隨機均分為假手術組、模型組和蘆丁組，每組10只。蘆丁組在缺血前 15 min腹腔注射蘆丁10 mg/kg，劑量參考文獻[7]，模型組腹腔注射等量生理鹽水，參照 Zea Longa方法[8]構建腦缺血再灌注損傷手術。在戊巴比妥鈉(6 mL/kg)麻醉下，SD大鼠頸部正中切開， 依次序貫分離右側頸總動脈、 頸外動脈和頸內動脈。結扎頸總動脈近心端及頸外動脈遠心端。在頸內動脈近端備線， 遠端放置動脈夾，頸總動脈切口，插入直徑為 0.286 mm 的標記魚線，松開動脈血管夾，標記魚線向頸內動脈插入約20 mm， 栓線進入頸內動脈，穿過大腦中動脈起始端至大腦前動脈近端。固定栓線， 計時， 逐層縫合手術切口， 消毒， 將動物放置籠中。缺血2 h 后將栓線拉出1 cm恢復血供行再灌注。假手術組除不插栓線外， 其余步驟同上。大鼠再灌注2 4 h 處死大鼠，收集血清和腦組織。

1.4 腦組織病理組織學檢查 腦組織置于 4%多聚甲醛液4 ℃后固定1周。依次脫水、透明、 浸蠟及包埋， 行厚 8 μm 冠狀切片、 常規 HE 染色、 封片， 光鏡下觀察，損傷評分參考文獻[6]。

1.5 RT-PCR檢測 IL-6, TNF-α 和 IL-8稱取適量腦組織，于液氮中研磨成粉末狀提取總RNA，紫外分光光度計測量濃度，逆轉錄以及擴增反應按試劑盒說明書。以管家基因β-actin作為內參對照基因，用各樣本的Ct值按公式2-ΔΔCT計算相對表達量。見表1。

表1 實時定量PCR檢測的引物序列

1.6 ELISA檢測血清中IL-6、TNF-α 和 IL-8 表達水平 按照ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測 血清中IL-6, TNF-α 和 IL-8表達水平。

1.7 Western blot檢測腦組織Wnt、β-catenin、cyclin D 1 和 survivin表達 取腦組織按照每50 mg組織中加入1 mL RIPA裂解液(以1∶50加入50×cocktail)，冰上勻漿，裂解30 min后，4 ℃ 12 000r/min離心30 min后取上清，BCA法測定蛋白濃度。以含50 μg蛋白質的上樣量，經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳(5%濃縮膠，10%分離膠，恒壓80～100 V)后轉膜(PVDF膜,恒流300 mA)，然后洗膜，以5%脫脂奶粉(TBST配制)封閉1 h，Wnt(1∶1000), β-catenin (1∶1 000)，cyclin D 1 (1∶1 000) ， survivin (1∶1 000)，β-actin(1∶3 000)單抗孵育過夜，再次振洗后加入羊抗兔IgG-HRP(二抗)37 ℃孵育1 h。洗膜后加ECL試劑，Kodak化學發光儀曝光顯示目的蛋白并拍照。以Quantity one對條帶進行定量分析，以目的條帶和β-actin條帶積分灰度值比值作為結果。

2 結 果

2.1 腦缺血再灌注損傷的病理改變 與假手術組

比較，模型組神經元細胞損傷，固縮核和神經元染色明顯增加(P<0.001)，而蘆丁組神經元細胞損傷，固縮核和神經元染色明顯降低(P<0.05)。顯示蘆丁預處理可明顯減輕腦缺血再灌注損傷導致的腦損害，其損傷評分見圖1。

圖1 HE檢測蘆丁對腦組織病理改變的影響(*P<0.001，▲P<0.05)

2.2 蘆丁對促炎癥細胞因子TNF-α、IL-6和 IL-8表達的影響 結果顯示與假手術組比較，模型組促炎癥細胞因子TNF-α、IL-6和 IL-8 表達明顯增加(P<0.001)，而蘆丁組與模型組比較，促炎癥細胞因子TNF-α、IL-6和 IL-8 表達明顯減少(P<0.05)，提示蘆丁預處理可減輕促炎癥細胞因子TNF-α、IL-6和 IL-8 在腦組織的表達 。見圖2。

圖2 RT-PCR檢測蘆丁對促炎癥細胞因子TNF-α， IL-6和 IL-8的表達影響(*P<0.001，▲P<0.05)

2.3 蘆丁可對促炎癥細胞因子TNF-α、IL-6和 IL-8的分泌的影響 結果顯示與假手術組比較，模型組促炎癥細胞因子TNF-α、IL-6和 IL-8分泌明顯增加(P<0.001)，而蘆丁組與模型組比較，促炎癥

細胞因子TNF-α、IL-6和 IL-8分泌明顯減少(P<0.05)，這提示蘆丁預處理可減輕促炎癥細胞因子TNF-α、IL-6和 IL-8 的分泌。見圖3。

圖3 ELISA檢測蘆丁對促炎癥細胞因子TNF-α、IL-6和 IL-8分泌的影響(*P<0.001，▲P<0.01，#P<0.05)

2.4 蘆丁對Wnt/β-catenin信號通路的影響 結果顯示與假手術組比較，模型組Wnt和β-catenin蛋白表達明顯增加(P<0.001)，而蘆丁組與模型組比較Wnt和β-catenin蛋白表達明顯減少 (P<0.05)，見圖4。蘆丁預處理可明顯抑制Wnt/β-catenin信號通路激活。

圖4 Western Blotting檢測蘆丁對Wnt和β-catenin蛋白表達影響

2.5 蘆丁對cyclin D 1 和 survivin表達的影響 結果顯示與假手術組相比，模型組cyclin D 1 和 survivin蛋白表達明顯增加(P<0.001)，而蘆丁組與模型組相比cyclin D 1 和 survivin 蛋白表達明顯減少 (P<0.05)，見圖5。蘆丁預處理可明顯減少cyclin D 1 和 survivin的表達。

圖5 Western Blotting檢測蘆丁對cyclin D 1 和 survivin蛋白 表達影響(*P<0.001，▲P<0.05)

3 討 論

最近研究[5-6]發現腦組織缺血可導致機體細胞缺氧，從而機體ATP合成減少，引起炎癥反應激活，腦組織血流灌注恢復后，炎癥反應進一步加劇導致大量神經元細胞凋亡，壞死，進而加劇腦組織損傷。因此減輕炎癥反應是減輕腦缺血再灌注損傷的有效治療途徑之一。

實驗結果顯示,腦缺血再灌注損傷可引起腦神經元細胞損傷，固縮核和神經元染色明顯增加，引發腦組織結構的改變，而蘆丁預處理可以明顯減輕腦缺血再灌注損傷導致的腦組織病理結構的改變，經蘆丁預處理后，神經元細胞損傷，固縮核和神經元染色明顯降低 。這提示蘆丁預處理可以明顯減輕腦缺血再灌注損傷，與既往的研究[5]報道一致。但具體機制不明，本組實驗結果顯示，與對照組比較，蘆丁組促炎癥細胞因子TNF-α、 IL-6和 IL-8 表達和分泌明顯減少, 提示蘆丁預處理可明顯抑制炎癥信號通路的激活,從而減輕腦缺血再灌注損傷。但蘆丁預處理抑制炎癥減輕腦缺血再灌注損傷的具體機制尚不清楚。Wnt/β-catenin信號途徑是一經典細胞信號通路，可介導細胞生長、細胞凋亡，細胞分化，代謝等[7]。cyclin D 1 和 survivin 是Wnt/β-catenin信號途徑激活的定向靶向基因[8]。研究[9]發現Wnt/β-catenin 信號通路激活可介導炎癥，而蘆丁可調節Wnt/β-catenin信號途徑[10]。本實驗結果顯示蘆丁可減少Wnt/β-catenin激活，和減少Wnt/β-catenin定向靶向基因cyclin D 1 和 survivin的表達。因此我們可以推測蘆丁可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路激活而減輕炎癥。

[1] Liu J, Li J, Yang Y, et al. Neuronal apoptosis in cerebral ischemia/reperfusion area following electrical stimulation of fastigial nucleus[J]. Neural Regen Res，2014， 9(7):727-734.

[2] Zhang X,Yan H,Yuan Y, et al. Cerebral ischemia-reperfusion-induced autophagy protects against neuronal injury by mitochondrial clearance[J]. Autophagy，2013， 9(9):1321-1333.

[3] Chua LS. A review on plant-based rutin extraction methods and its pharmacological activities[J]. J Ethnopharmacol，2013， 150(3):805-817.

[4] Chan PC, Xia Q, Fu P. Ginkgo biloba leave extract: biological, medicinal, and toxicological effects[J]. J Environ Sci Health C Environ Carcinog Ecotoxicol Rev，2007， 25(3):211-224.

[5] Liu H, Wei X, Kong L,et al. NOD2 is Involved in the Inflammatory Response after Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury and Triggers NADPH Oxidase 2-Derived Reactive Oxygen Species[J]. Int J Biol Sci，2015， 11(5):525-535.

[6] Liu FF, Liu CY, Li XP,et al.Neuroprotective effects of SMADs in a rat model of cerebral ischemia/reperfusion[J]. Neural Regen Res，2015，10(3):438-444.

[7] Zhang X, Lou Y, Zheng X, et al. Wnt blockers inhibit the proliferation of lung cancer stem cells[J]. Drug Des Devel Ther，2015，9:2399-2407.

[8] Shan BE, Wang MX, Li RQ, et al. Quercetin inhibit human SW480 colon cancer growth in association with inhibition of cyclin D1 andsurvivin expression through Wnt/beta-catenin signaling pathway[J]. Cancer Invest，2009， 27(6):604-612.

[9] Liu B, Tang J, Li S, et al. Involvement of the Wnt signaling pathway and cell apoptosis in the rat hippocampus followingcerebral ischemia/reperfusion injury[J]. Neural Regen Res，2013，8(1):70-75.

[10] Amado NG, Fonseca BF, Cerqueira DM, et al.Effects of natural compounds on Xenopus embryogenesis: a potential read out for functional drug discovery targeting Wnt/β-catenin signaling[J]. Curr Top Med Chem，2012，12(19):2103-2113.

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1000-744X(2016)04-0365-03

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