野生水芹的急性毒性及遺傳毒性研究

王雨 吳克楓 俞紅 劉泳廷 劉佳

(貴州省疾病預防控制中心，貴州 貴陽 550004)

野生水芹的急性毒性及遺傳毒性研究

王雨 吳克楓 俞紅 劉泳廷 劉佳

(貴州省疾病預防控制中心，貴州 貴陽 550004)

野生水芹； 急性毒性； 遺傳毒性

野生水芹[Oenanthe javanica (BI．) DC．簡稱水芹]，隸屬于傘形科水芹屬，又名楚葵、野芹菜，為多年水生宿根草本植物[1]。近年來國內外學者對水芹的活性成分開展分析并通過動物藥理實驗研究證實，水芹含有揮發油類、甾醇類、醇類、脂肪酸類、黃酮類等成分，在抗肝炎、抗心律失常、抗糖尿病和降血壓、降血脂等方面具有多方面用途，被認為是一種優質的保健蔬菜[2-3]，但其毒性研究少見報道，本研究為探討水芹安全性，選用了急性毒性和遺傳毒性試驗對其進行毒理學檢測。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

水芹由市場購得，選用地上可食部分，洗凈晾干后放入70 ℃通風式烘箱中干燥至恒質量，粉碎過100目篩，放置干燥器中備用。1 g干粉等于13 g水芹鮮重。實驗中劑量均指鮮重。

本研究所用動物為SPF級昆明小鼠，購自貴州醫科大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號SCXK(黔)2012-0001，動物質量合格證號：小鼠0201504、0201211，購進動物適應性喂養3 d，輻照滅菌清潔級飼料由蘇州雙獅實驗動物飼料科技有限公司提供。飼料合格證號為蘇飼審(2009)05032。動物房為屏蔽環境，溫度18～24 ℃，濕度40%～70%。實驗動物使用許可證號SYXK(黔)2014-001。

1.2 主要儀器及試劑

生物顯微鏡、手術器械、恒溫培養箱、高壓滅菌器、恒溫水浴搖床、電子天平、全自動菌落計數儀、常規試劑。

1.3 實驗方法

參照中華人民共和國衛生部2003年《保健食品檢驗與評價技術規范》[4]。

1.3.1 急性毒性實驗 實驗采用最大耐受劑量法。選用體質量為18～22 g昆明種小鼠20只，雌雄各半。根據急性毒性劑量分級標準，試驗劑量設為15 g/(kg·bw)灌胃前禁食16 h，灌胃后連續觀察兩周，記錄動物中毒表現及死亡情況。

1.3.2 Ames試驗 采用平板摻入法，測試菌株為TA97、TA98、TA100、TA102，經鑒定各種生物學特性均符合要求。受試物劑量為8、40、200、1 000、5 000 μg/皿，同時設自發回變、溶劑對照和陽性對照，在加和不加S9混合液的條件下分別進行測試。整套試驗在相同條件下重復做兩次。

1.3.3 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核實驗 選用昆明種小鼠50只，體質量25～30 g，隨機分為5組，每組10只，雌雄各半，以環磷酰胺50 mg/(kg·bw)劑量為陽性對照，蒸餾水為陰性對照，試驗組高、中、低3個劑量分別為10.00 g/(kg·bw)、5.00 g/(kg·bw)、2．50 g/(kg·bw)。采用間隔24 h兩次經口灌胃法進行試驗，于第2次給予受試物后6 h頸椎脫臼處死動物，取胸骨制片，甲醇固定，Giemsa染色，每只動物油鏡下觀察1 000個嗜多染紅細胞(PCE)中出現的微核細胞數，計算微核率(‰)，計數200個PCE的同時計數觀察到的正染紅細胞(NCE)數，并計算PCE/NCE比值。

1.3.4 小鼠精子畸形試驗 選用體質量25～35 g雄性昆明種小鼠25只，隨機分為5組，每組5只，以環磷酰胺50 mg/(kg·bw)劑量為陽性對照，蒸餾水為陰性對照。實驗組高、中、低3個劑量分別為10.00 g/(kg·bw)、5.00 g/(kg·bw)、2．50 g/(kg·bw)連續5 d經口灌胃給予受試物，于首次灌胃后35 d頸椎脫臼處死動物，取雙側附睪制片，伊纖染色，每只小鼠觀察1 000個完整精子，計算精子畸形率(%)。

1.4 統計學處理

采用SPSS 18.0軟件包進行統計學分析，P<0．05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 急性毒性試驗

以15 g/(kg·bw)劑量的水芹灌胃20只小鼠(雌雄各半)，未觀察到實驗動物出現中毒癥狀和死亡，樣品MTD>15 g/(kg·bw)屬急性無毒級。

2.2 Ames試驗

自發回變、溶劑對照菌落數均在正常范圍，加與不加S9混合液的受試物各劑量組的回變菌落數與陰性對照組的回變菌落數之比(MR)均<2，亦無劑量-反應關系，而陽性對照組與溶劑對照組的回變菌落數之比>2。表明水芹無誘 導TA97、TA98、TA100、TA102回復突變能力，見表1，2。

劑量/(μg/皿)TA97-S9+S9TA98-S9+S9TA100-S9+S9TA102-S9+S98161±34132±1739±349±5154±36144±39304±63325±5640140±42133±32 17±1442±2163±46157±66282±98295±56200132±33124±1224±830±8155±45183±20287±33353±741000167±35200±1325±7 31±22168±58167±45327±47287±465000156±39161±4424±4 32±13175±37162±53357±31263±44蒸餾水170±25148±2733±638±4186±14189±8 248±32263±34DMSO151±24149±1738±840±4155±17158±18289±20288±14敵克松2284±2121137±84 MMS3116±936108±3772?AAF1743±1416567±4503011±1201．8?二羥基蒽醌899±163

劑量/(μg/皿)TA97-S9+S9TA98-S9+S9TA100-S9+S9TA102-S9+S98145±31176±3126±238±9128±13175±47316±67 328±10240140±29133±3223±839±9120±21135±30334±32285±16200134±50161±3429±739±4179±34140±28289±11319±291000140±31183±29 37±1119±8138±30130±32329±63320±465000208±22134±1631±642±9150±21142±25314±42302±76蒸餾水159±9166±934±747±4193±7 181±12285±28273±42DMSO149±17150±1938±839±8152±17146±16282±31262±22敵克松268±1471859±530MMS3144±1216254±3872?AAF1666±134 6187±1283272±4581．8?二羥基蒽醌?873±124

2.3 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗

各劑量組微核率與陰性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，陰性對照組與環磷酰胺組比較差異有統計學意義(P<0.01)。各組PCE/NCE值均在正常值范圍內。故在本試驗劑量范圍內，小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗結果為陰性，見表3。

性別劑量/[g/(kg·bw)]動物數/只觀察PCE數/個含微核PCE數/個微核率/‰PCE/NCE2．505500081．60±0．891．64±0．175．005500081．60±0．551．60±0．25雄性10．0055000102．00±1．222．33±0．84陰性對照55000112．20±1．102．26±0．63環磷酰胺55000172 34．40±10．41?1．40±0．832．505500081．60±0．551．90±0．335．005500051．00±0．001．69±0．23雌性10．005500081．60±0．551．64±0．20陰性對照5500061．20±0．452．04±0．54環磷酰胺5500018436．80±6．98?1．15±0．62

注:與陰性對照組比較，*P<0．01。

2.4 小鼠精子畸形試驗

陰性對照組與環磷酰胺組比較差異有統計學意義(P<0.01)，各劑量組與陰性對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，且有明顯的劑量-反應關系，故在本試驗劑量范圍內，小鼠精子畸形試驗結果為陽性。見表4。

劑量/[g/(kg·bw)]動物數/只觀察精子數/個香蕉/個精子畸形類型/個無鉤不定形其他精子畸形合計畸形數/個畸形率/%2．505500071860391242．48±0．37?5．0055000205783492094．18±0．85??10．00550003487109162464．92±0．96??陰性對照5500010144324911．82±0．19環磷酰胺55000106104130914318．62±0．98??

注：與陰性對照組比較，*P<0.05；與陰性對照組比較，**P<0．01。

3 討 論

急性毒性試驗可在短時間內觀察給予受試物后動物所產生的毒性反應，為進一步進行毒性試驗的劑量提供依據；遺傳毒性試驗的組合應考慮原核細胞與真核細胞、生殖細胞與體細胞、體內與體外試驗相結合的原則，對受試物的遺傳毒性以及是否具有潛在致癌作用進行篩選。Ames試驗廣泛應用于檢測化學物的致突變性，是原核細胞基因突變試驗的首選；微核與染色體損傷有關，測定骨髓PCE的微核發生率是檢測細胞遺傳損傷的一個非常有效的指標；精子畸形試驗能夠檢測多種類型的化學物對生殖細胞的誘變作用[5]。本次我們對水芹進行了急性毒性和遺傳毒性的研究，水芹的小鼠精子畸形試驗各劑量組精子畸形率均顯著高于陰性對照組，且呈劑量-反應關系，表明水芹可能對生殖細胞有誘變作用。

水芹的黃酮類物質含量是旱芹的2倍[6]，其中芹菜素的含量也高于其他蔬菜[7]。國內外學者對黃酮安全性的研究存在分歧，一方面黃酮類化合物被認為具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性[8]；另一方面一些體外實驗和動物實驗發現了某些黃酮類化合物具有毒副作用，包括遺傳毒性、致癌毒性、抗營養效果等[9]。Rueff等[10]認為黃酮類化合物在體內的代謝可以部分解釋遺傳毒性和致癌性研究得出沖突結論的原因。芹菜素屬黃酮類化合物，有研究[11-12]發現，芹菜素可致精子質量及形態變化，對睪丸組織有一定的損傷作用[13]，提示具有遺傳毒性。故水芹致小鼠精子畸形率升高可能與芹菜素的作用有關，具體作用機制有待進一步研究。水芹資源在我國各地均有分布，尤以中東部和南方各省更為多見，是很多地區的傳統特色水生蔬菜，但本次實驗研究表明，在未進行綜合全面的安全性評價之前，不宜盲目大量開發采食野生水芹。

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