七氟烷后處理減輕兔肺缺血再灌注損傷中AQP1的表達(dá)及意義研究

陳玉姣 艾祥發(fā) 羅夢(mèng)秋 李雪 竇雪嬌 張紅

(遵義醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)系，貴州 遵義 563000)

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七氟烷后處理減輕兔肺缺血再灌注損傷中AQP1的表達(dá)及意義研究

陳玉姣 艾祥發(fā) 羅夢(mèng)秋 李雪 竇雪嬌△張紅

(遵義醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)系，貴州 遵義 563000)

目的 探討水通道蛋白1(aquaporin1，AQP1) mRNA在七氟烷后處理中對(duì)兔肺組織的作用。方法 選擇新西蘭大白兔12只，雌雄不拘，隨機(jī)分為兩組，每組6只：I組為肺缺血再灌注損傷模型組；S組為七氟烷后處理組。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于阻斷左肺門(mén)前(T1)、阻斷左肺門(mén)60 min(T2)、實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(T3)3個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別檢測(cè)肺組織AQP1mRNA表達(dá)及病理改變，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)檢測(cè)肺濕/干重比。結(jié)果 兩組肺組織AQP1mRNA表達(dá)隨時(shí)間推移逐漸下降；T3時(shí)點(diǎn)，S組AQP1mRNA表達(dá)高于I組，肺濕/干重比低于I組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 七氟烷后處理對(duì)肺缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，可能與AQP1mRNA表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

缺血再灌注損傷； 七氟烷； 水通道蛋白1

肺缺血再灌注損傷 (lung ischaemia-reperfu-sion injury,LIRI)常見(jiàn)于肺移植術(shù)、體外循環(huán)手術(shù)、肺栓塞溶栓治療和休克等，可使患者產(chǎn)生肺動(dòng)脈高壓、肺水腫及呼吸衰竭，影響患者的住院時(shí)間和術(shù)后恢復(fù)，甚至導(dǎo)致死亡。探尋LIRI的發(fā)生機(jī)制和有效可行的防治方法，是近年人們研究的熱點(diǎn)方向。本研究在LIRI后進(jìn)行七氟烷后處理，觀察其對(duì)肺組織AQP1mRNA表達(dá)的影響，旨在深入探討LIRI的發(fā)生機(jī)制，為今后尋找有效可行的防治方法奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)材料有：七氟烷(魯南貝特制藥有限公司)，RY-ⅡB麻醉工作站，金科威UT4000 Fpro有創(chuàng)監(jiān)護(hù)儀，ABI 7900 qPCR儀，5804R型Eppendorf臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，新西蘭大白兔12只，雌雄不拘(遵義醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，隨機(jī)分為兩組：肺缺血再灌注損傷模型組(I組)、七氟烷后處理組(S組)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 (1)動(dòng)物模型制備：兔腹腔內(nèi)均注射2.5﹪戊巴比妥鈉25 mg/kg，仰臥位固定，氣管插管后連接呼吸機(jī)，常規(guī)監(jiān)測(cè)。維持潮氣量12～15 mL/kg，呼吸頻率16次/min，Ⅰ∶E=1∶2，F(xiàn)iO2∶99%。Ⅰ組分離左肺門(mén)，阻斷左肺門(mén)60 min后開(kāi)放左肺門(mén)60 min，實(shí)驗(yàn)結(jié)束；S組在開(kāi)放左肺門(mén)的同時(shí)吹入2.2%七氟烷30 min，其余步驟與I組相同，后快速洗肺5 min，繼續(xù)使用呼吸機(jī)維持呼吸25 min，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。兩組分別在阻斷左肺門(mén)前、阻斷左肺門(mén)60 min時(shí)、實(shí)驗(yàn)結(jié)束即阻斷后又開(kāi)放60 min時(shí)取左肺組織。(2)肺組織病理學(xué)檢查：取左肺組織固定于10%福爾馬林液中，脫水，石蠟包埋切片，HE染色，用光鏡檢測(cè)。(3)RT-PCR法檢測(cè)兔肺組織AQP1mRNA的表達(dá)：用Trizol提取肺組織總RNA，用紫外分光光度儀測(cè)定其在260 nm和280 nm處的吸光度，測(cè)RNA的純度與濃度，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后保存于-20 ℃待用，在PCR儀中行擴(kuò)增反應(yīng)。Rabbit-β-actin上游引物為5′-TGGCTCTAACAGTCC GCCTAG-3′，下游引物為5′-AGTGCGACGTGGA CATCCG-3′，Rabbit-AQP1上游引物為5′-CTAC ACTGGCTGTGGCATTA-3′，下游引物為5′-GCC AGGATAAAGTCGTAGATGAG-3′，退火溫度65 ℃，40個(gè)循環(huán)，試劑盒及引物由大連Takara生物工程公司提供。(4)肺組織濕/干重比測(cè)定：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取兔左肺組織用濾紙吸干表面水分，分析天平秤濕重后，60 ℃烤箱中放置72 h秤干重，計(jì)算濕/干重比。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況比較 兩組兔子的體質(zhì)量、雌雄構(gòu)成等差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 肺組織AQP1mRNA表達(dá)的變化 兩組T1時(shí)間點(diǎn)肺組織AQP1mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；隨著時(shí)間推移，兩組AQP1mRNA表達(dá)逐漸降低，I組T3時(shí)點(diǎn)降低更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；S組與I組比較，T3時(shí)點(diǎn)S組肺組織AQP1mRNA表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 肺組織AQP1 mRNA表達(dá)的比較

注：同組間與T1比較時(shí)，*P<0.05；同組間與T2比較時(shí)，□P<0.05；同時(shí)點(diǎn)與Ⅰ組比較時(shí)，△P<0.05

2.3 肺濕/干重比的變化 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)S組濕/干重比(4.3±0.4)明顯低于Ⅰ組(5.6±0.2)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 肺組織HE染色病理形態(tài)學(xué)比較 兩組患者T1時(shí)間點(diǎn)肺組織結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1。T3時(shí)間點(diǎn)I組的肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺間質(zhì)明顯增寬，肺泡腔內(nèi)充滿大量水腫液，見(jiàn)紅細(xì)胞滲出，見(jiàn)圖2；S組肺組織結(jié)構(gòu)基本清晰，肺間質(zhì)增寬，肺泡腔內(nèi)有少量水腫液，見(jiàn)炎性細(xì)胞及紅細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖3。

圖1 I組T1時(shí)點(diǎn)肺組織(HE染色×400)

圖2 I組T3時(shí)點(diǎn)肺組織(HE染色×400)

圖3 S組T3時(shí)點(diǎn)肺組織(HE染色×400)

3 討 論

LIRI[1]是指缺血的組織細(xì)胞恢復(fù)灌注后不但不能迅速恢復(fù)正常的代謝機(jī)能，反而加重其損傷，主要表現(xiàn)為再灌注組織充血、水腫。研究[2]表明，在肺移植手術(shù)后1 h，導(dǎo)致患者死亡的主要原因就是LIRI導(dǎo)致的肺功能障礙，因此研究減輕LIRI的措施十分重要。

近年來(lái)，由于七氟烷誘導(dǎo)快、蘇醒迅速、刺激小等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于臨床,研究表明七氟烷可明顯減輕患者開(kāi)胸手術(shù)行單肺通氣時(shí)肺部炎癥因子白介素6、8、10及C反應(yīng)蛋白等的表達(dá)[3]；也可降低脂多糖導(dǎo)致的肺部炎癥反應(yīng)[4]。大鼠肺缺血再灌注模型中，張素晶等[5]研究表明，七氟烷(呼氣末濃度為2.1%)后處理持續(xù)30 min，可減輕大鼠LIRI，可能與降低肺組織炎性反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。同時(shí)Jun[6]也報(bào)道，2.2%七氟烷吸入可改善大鼠肺血管通透性，從而減輕LIRI。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：兩組T3時(shí)點(diǎn)較T1時(shí)點(diǎn)，兔肺組織濕/干重比均升高，光鏡示肺間質(zhì)明顯增寬，肺泡腔內(nèi)大量水腫液，說(shuō)明兔肺缺血再灌注后肺水腫加重；但S組較I組T3時(shí)點(diǎn)肺濕/干重比降低，肺泡腔內(nèi)水腫液有所減少，說(shuō)明七氟烷后處理可以明顯改善兔LIRI導(dǎo)致的肺水腫。在臨床中，肺缺血時(shí)機(jī)常常難以掌控，而藥物后處理是當(dāng)肺組織缺血后，行再灌注前或再灌注即刻使用藥物進(jìn)行干預(yù)的方法，故后處理相較預(yù)處理具有更強(qiáng)的臨床可操作性。

AQP1屬于水通道蛋白家族的成員之一，主要分布于肺微血管內(nèi)皮的質(zhì)膜、支氣管周圍血管床、氣管粘膜上皮、淋巴管和胸膜以及肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，主要負(fù)責(zé)清除支氣管和脈管周圍組織內(nèi)的水分[7]，參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞通透性和屏障功能[8]。在犬體外循環(huán)中應(yīng)用乙酰唑胺，AQP1表達(dá)下調(diào)，肺水明顯增加，Pa O2和RI升高，OI降低，肺損傷加重[9]。而對(duì)體外循環(huán)犬肺組織進(jìn)行缺血后處理，AQP1表達(dá)上調(diào)，肺損傷減輕[10]。在生理?xiàng)l件下，AQP1參與構(gòu)成血?dú)馄琳蠚怏w側(cè)的水分子通路。對(duì)維持血管與間質(zhì)之間的水運(yùn)動(dòng)平衡意義重大。在肺缺血再灌注期間，光鏡下可見(jiàn)肺不張伴不同程度肺氣腫，肺間質(zhì)增寬、水腫，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡內(nèi)較多紅細(xì)胞滲出[11]，此時(shí)伴有水轉(zhuǎn)運(yùn)的紊亂，AQP1數(shù)量、分布、功能等的改變。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，兩組T2、3時(shí)點(diǎn)AQP1mRNA表達(dá)均明顯低于T1時(shí)點(diǎn)，T3時(shí)點(diǎn)濕/干重比升高并可見(jiàn)肺間質(zhì)明顯增寬，肺泡腔內(nèi)大量水腫液，說(shuō)明兔LIRI后AQP1mRNA減少時(shí)肺水轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生障礙，肺水腫加重；但S組較I組T3時(shí)點(diǎn)AQP1mRNA表達(dá)升高，濕/干重比降低，肺間質(zhì)稍增寬，肺泡腔內(nèi)水腫液有所減少，說(shuō)明兔LIRI后使用七氟烷AQP1mRNA表達(dá)增高，肺水腫減輕，提示七氟烷可能通過(guò)上調(diào)AQP1mRNA的表達(dá)，改善肺水腫，減輕肺損傷。

綜上所述，七氟烷作為一種新型的吸入麻醉藥，可能通過(guò)上調(diào)AQP1mRNA的表達(dá)，改善肺水腫，減輕兔肺缺血再灌注損傷。

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Role of aquaporin 1 reducing lung ischemia-reperfusion injury by sevoflurane post-treatment in rabbits

ChenYujiao,AiXiangfa,LuoMengqiu,LiXue,DouXuejiao,ZhangHong.

DepartmentofAnesthesioIogy,ZunyiMedicaICollege,Zunyi563003,Guizhou,China.Correspondingauthor:DouXue-jiao,Email:douxuejiao-0603@163.com.

ObjectiveTo evaluate the role of aquaporin 1 (AQP1) mRNA expression by sevoflurane post-treatment in rabbits lung.Methods Twelve healthy New Zealand rabbits were randomly divided into 2 group (n=6 each) which were lung ischemia-reperfusion group (group I),sevoflurane post-treatment (group S).The lung tissues were obtained for determination of AQP1mRNA and microscopic examination at before blocked the left lung,at blocked the left lung 60 min and at the end of the experiments (T1-3).Lung tissues were gathered to determine the wet/ dry weight ratio ( W/ D).Results Compared with group T1,both of two groups AQP1mRNA expression was down-regulated at T2,3.The expression of AQP1mRNA group S was higher than group Ⅰ at T3,but lung W/ D was contrary (P<0.05).Conclusion sevoflurane post-treatment increases the expression of AQP1mRNA,provides a protective effect on lung suffering from ischemia-reperfusion injury in rabbits.

Ischemia-reperfusion injury； Sevoflurane； AQP1

大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(1.貴州省201410661004；2.遵義醫(yī)學(xué)院院發(fā)[2013]6505)

R-332;R641

A

1000-744X(2016)12-1246-03

2016-10-23)

△通信作者，E-mail:douxuejiao0603@163.com