下頜前導后大鼠髁突軟骨Runx2的表達研究

秦波 王小玲 徐衛(wèi)華

(貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院口腔正畸科，貴州 貴陽 550004)

?

下頜前導后大鼠髁突軟骨Runx2的表達研究

秦波 王小玲 徐衛(wèi)華△

(貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院口腔正畸科，貴州 貴陽 550004)

目的 觀察大鼠下頜持續(xù)功能前導后髁突軟骨中Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)的表達，探討Runx2在大鼠下頜前導后髁突軟骨不同部位改建中可能發(fā)揮的作用。方法 40只35 D齡雄性SD大鼠隨機分為實驗組和對照組，各為20只，實驗組大鼠24 h戴自制功能性矯治器引導下頜前伸，對照組不做處理，在試驗后第3、7、14、28天時每組處死大鼠5只，采用免疫組化方法觀察髁突軟骨中Runx2的表達情況。結(jié)果 實驗組Runx2的表達在實驗后第7、14、28天與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；實驗組髁突后部區(qū)域Runx2的表達與前部和中部比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論 Runx2可能參與了下頜骨髁狀突骨改建過程；下頜前導后髁突軟骨不同部位軟骨的改建可能不同。

髁突軟骨； 下頜前導； Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2

髁突軟骨在髁突表面，是一種特殊形式的結(jié)締組織，不包含神經(jīng)纖維、血管和淋巴管，是整個下頜骨的生長和發(fā)育的中心。髁突的生長改建直接影響下頜的形態(tài)和功能。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2，Runx2)又稱核心結(jié)合因子α1(core-binding factorα1．CBFA1),Runt相關(guān)基因Runx家族蛋白由Runx1、Runx2和 Runx3組成，其共同特點是在他們的分子中含有一個相似的高度保守序列——Runt結(jié)構(gòu)域[1],該結(jié)構(gòu)域與果蠅的成對控制基因Runt序列同源。Runx2是成骨細胞分化和軟骨內(nèi)成骨的主要調(diào)節(jié)因子，在成骨細胞分化、軟骨細胞成熟及骨基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生等過程中均發(fā)揮著重要作用。本研究通過模擬臨床功能矯治器，建立大鼠下頜持續(xù)前導的動物模型，通過檢測大鼠髁突軟骨前部、中部和后部中Runx2的表達并對其進行定量分析，探討大鼠下頜前伸后髁突軟骨的骨改建及Runx2對髁突不同部位軟骨骨改建的影響。報告如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 選擇健康雄性35 d齡SD大鼠(貴州醫(yī)科大學動物實驗中心提供)40只，隨機分為實驗組和對照組，各為20只。大鼠咬合前導裝置的制作參照Rabie等[2]，實驗組模擬臨床功能矯治器引導下頜前伸；對照組不做處理。分別在試驗后第3、7、14及28天全麻下處死實驗組及對照組每時間段動物各5只。所有動物都以自由飲水、飲食，同環(huán)境下飼養(yǎng)直至實驗結(jié)束。

1.2 主要實驗材料 實驗材料有：Rabbit Anti-CBFA10.1 mL(200 ug/mL，武漢博士德生物工程有限公司)，增強型(Polink-1)檢測試劑盒，PV-6001 兔兩步法檢測試劑6mL(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 組織處理 分別于安裝前導裝置后的第3、7、14、28天，處死實驗組和對照組動物各5只。0.3%戊巴比妥鈉1 mL/100 g腹腔注射，組織分離，整塊取下髁狀突。10%福爾馬林溶液固定24 h,EDTA液脫鈣4周，常規(guī)脫水，石蠟包埋。

1.4 免疫組織化學染色 石蠟縱向切片，脫水，抗原修復，去離子水孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。PBS液洗3次，每次3 min，滴加一抗4 ℃冰箱過夜，PBS液洗3次，每次2 min，加入兔IgG抗體-HRP多聚體工作液37 ℃溫箱孵育30 min，PBS液洗3次，每次2 min，DAB顯色，自來水終止顯色，蘇木素染色30 s，自來水沖洗，酸酒精處理10 s,氨酒精1 min脫水透明，樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，大鼠氣管軟骨組織作為陽性對照，以細胞胞漿為特異黃色或棕黃色為染色陽性。

1.5 圖像分析 在矢狀切片上通過髁狀突前后面最突點作一直線，選取該直線中點以60°為標準將髁狀突上部分為前部、中部和后部。OlympusCX31型光學顯微鏡下應用Pixera PVC100 C系統(tǒng)采圖，各組織采集100×圖像，Photoshop 8.0軟件選取髁突軟骨前中后部進行觀測，每部分選擇連續(xù)3個100px×100px大小的區(qū)域，計數(shù)各區(qū)域棕色深染的陽性細胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗組與對照組之間比較用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 Runx2在髁突軟骨前部的表達 對照組中的表達隨著觀測時間點的向后推移，Runx2的陽性細胞沒有顯著變化趨勢。實驗組中Runx2的表達隨著觀測點的向后推移，Runx2的陽性細胞逐漸增加，實驗后第3、7天與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),第14和28天與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。實驗組內(nèi)Runx2的表達第3天與第7天比較差異無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，第3天與14、28天比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

n3d7d14d28d對照組513.20±1.4713.60±1.7113.60±1.6513.40±1.42實驗組513.80±1.4114.70±1.6415.80±1.54*15.90±0.99*F0.8712.1569.47020.604P0.3630.1590.006*0.000*

*注：與對照組相比，*P<0.01。

2.2 Runx2在髁突軟骨中部的表達 下頜前伸導致了實驗組髁突軟骨中部Runx2的表達增強，實驗后第3天與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，實驗后第7、14和28天與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。實驗組內(nèi)Runx2的表達第3天與第7、14、28天比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表2。

3d7d14d28d對照組(n=5)14.10±1.2013.90±1.1913.20±1.2913.10±1.52實驗組(n=5)14.40±1.1715.80±1.23*16.50±1.64*16.90±1.67*F0.32012.26025.72428.376P0.5780.003*0.000*0.000*

*注：與對照組相比，*P<0.01。

2.3 Runx2在髁突軟骨后部的表達 實驗組內(nèi)Runx2的表達實驗后第3天與第7、14、28天比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。同一觀測時間點內(nèi)髁突軟骨后部Runx2的表達與中部和前部比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。下頜前伸后髁突軟骨后部第3天與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);實驗后第7、14和28天表達與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表3。

n3d7d14d28d對照組515.90±1.2015.40±1.2615.00±1.3314.70±1.70實驗組516.40±1.1717.80±1.03*18.60±1.71*18.80±1.81*F0.88921.60027.50927.162P0.3580.000*0.000*0.000*

*注：與對照組相比，*P<0.01。

3 討 論

髁突軟骨是直接接觸關(guān)節(jié)盤的部位，因而其改建直接反映了外力對髁突的影響，髁突生長改建直接影響下頜的形態(tài)和功能。覆蓋于下頜髁突關(guān)節(jié)表面的纖維軟骨，是髁突改建能力的基礎(chǔ)，研究[3]表明顳頜關(guān)節(jié)具有終身改建能力,尤其是在幼年期及青少年改建能力較強。髁突的改建易受環(huán)境因素影響，張紅梅等[4]通過升高后牙咬合，增加了垂直向的距離，改變了下頜的位置，從而改變了髁突的位置及負荷，髁突進行了適應性改建。

Runx蛋白在多種細胞譜系中發(fā)揮著十分重要的作用，Runx1參與造血干細胞的分化，而Runx2在成骨細胞分化、軟骨細胞成熟及骨基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用，Runx3在胃上皮細胞調(diào)控中發(fā)揮重要作用。Runx2是首個被證實的成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，其能激活與啟動骨髓間質(zhì)干細胞向成骨細胞系分化，還能調(diào)節(jié)成骨細胞的成熟[5-6]。

Inada等[7]利用原位雜交技術(shù)對Runx2在軟骨細胞中的表達進行研究，發(fā)現(xiàn)隨軟骨細胞的成熟，Runx2的表達增加明顯，在終末肥大軟骨細胞中的表達量很大。在前軟骨形成細胞ATDC5中，抑制所有Runx蛋白的DN-Runx2(dominant negative Runx2)會抑制細胞凝聚，提示Runx蛋白參與軟骨形成的早期階段。Enomoto等[8]證實在ATDC5細胞中，I型Runx2的表達在細胞分化成為以表達X型膠原為特征的肥大軟骨細胞以前就已經(jīng)上調(diào)；用I型Runx2反義寡核苷酸作用于ATDC5細胞后，X型膠原的表達量明顯減少，說明其抑制了軟骨細胞的成熟；進一步將Runx2作用于小雞不成熟的軟骨細胞，發(fā)現(xiàn)其加快軟骨細胞的成熟。

本實驗中，前導大鼠下頜后髁突軟骨Runx2的表達實驗組在第7、14、28天強于對照組，實驗組隨著時間的推移大鼠髁突軟骨中Runx2的表達逐漸增強，提示Runx2可能參與了下頜前導后髁突軟骨的改建過程，同時Runx2的表達可能與時間有關(guān)。實驗組髁突軟骨后部Runx2的表達強于中部和前部，Runx2是生物力學信號的靶目標，用低振幅機械牽張力連續(xù)作用牙周膜細胞能迅速增加Runx2與DNA、成骨細胞特異性元件2的結(jié)合能力，凝膠滯留移動實驗表明在機械牽張30 min后，可以檢測到Runx2與成骨細胞特異性元件2的結(jié)合，6 h后達峰值，12 h后仍可檢測到。研究表明ERK1/2磷酸化程度在機械拉伸作用下與時間正相關(guān)，拉伸激活的ERK能同Runx2結(jié)合并使Runx2磷酸化，同時Runx2結(jié)合活性與之呈正相關(guān)，與本實驗中觀測到的髁突不同應力區(qū)Runx2表達強度不同一致，可能是因為不同應力作用下髁突軟骨改建的水平不同，髁突軟骨在髁突后部的張應力作用下，髁突軟骨細胞增殖明顯。

趙志河等[9]通過建立“下頜骨矯形系統(tǒng)”的三維有限元模型，對下頜前導時髁突的受力進行研究，結(jié)果顯示髁突軟骨表面的前部為壓應力集中區(qū)，后上部則為張力區(qū)，髁突發(fā)生向前向下的位移，認為前伸下頜能促進下頜髁突的生長，與本實驗結(jié)果相符。本研究實驗組在同一時間點Runx2表達在髁突后部要強于前部和中部，提示Runx2的表達可能與下頜前導后髁突不同部位所產(chǎn)生的應力不同有關(guān)。

[1] Levanon D，Negreanu V，Bernstein Y，et al.AML1，AML2 and AML3，the human members of the runt domain gene-family：cDNA structure expression，and chromosomal localization[J]．Genomics，1994，23：425-432．

[2] Rabie AB,Zhao Z,ShenG,et al.Osterogenesis in the glenoid fossa in response to mandibular advancement[J].Am Jorthod Denfacial Orthop,2001,119(4):390-400.

[3] Cholasueksa P,Warita H,Soma K，et al.Alterations of the rat temporomandibular joint in functional posterior displacement of the mandible[J].Angle Orthod,2004,74(5):677-683.

[4] 張紅梅，丁寅,王歡，等.升高咬合對青春期大鼠髁突軟骨改建的影響[J].第四軍醫(yī)大學學報，2007,28(6)：524-526.

[5] KomoriT.Runx2,amultifunctional transcription factor in skeletal development[J].Cell Biochem,2002,87(1):1-8.

[6] Ken O,Linda JS.Extracellular matrix gene regulation[J].Clin Orthop,2004,427(10):123-128.

[7] Inada M,Yasui T，Nomura S，et a1．Maturational disturbance of chondrocytes in cbfa1-deficient mice[J]．Dev Dyn，1999，214：279-290．

[8] Enomoto H，Enomoto-Lwamoto M，Lwamoto M，et a1．Cbfa1 is a positive regulatory factor in chondrocyte maturation[J]．J Biol Chem,2000,275：8695-8702．

[9] 趙志河，周學東,趙美英.下頜前伸時髁突的三維有限元分析[J].中華口腔醫(yī)學雜志,1999,34(2):85-87.

Expression of BMP-2 in the condyle of rat during mandibular advancement

QinBo,WangXiaoling,XuWeihua.

DepartmentofOrthodontics,TheAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China.

ObjectiveTo observe the expression of Runt-related transcription factor 2 (Runx2) in the condyle of rat during mandibular advancement,and explore the possible function in the remodeling of condyle cartilage in response to change of mandibular position.Methods Total of 40 of 35-day-old male Spague-Dawley (SD) rats were randomly divided into 4 groups.Each group consisted of 5 rats with bite-jumping appliance,which caused mandubular protrusion and 5 rats untreated as the control.One group was sacrificed on day 3,7,14 and 28 respectively.The expression of Runx2in the condyle cartilage was examined by immunohistochemical staining.Results The expression level of Runx2in experimental group was higher than in control group on days 7,14,28 (P<0.05)，The expression of Runx2in posterior region was stronger than anterior and middle regions in experimental group (P<0.05).Conclusion Runx2participate in the remodeling activities of cartilage,and has close relations to the endochondral ossification process.Mandibular cartilage remodeling may be different in the stretched region and loaded area.

Condyle cartilage； Mandibular advancement； Runt-related transcription factor 2

R-332；R313；R783.5

A

1000-744X(2016)12-1252-03

2016-10-23)

△通信作者,E-mail:29574748@qq.com