瘦素對(duì)HepG2細(xì)胞端粒酶及端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的調(diào)控作用研究

曹坤 李海洋

(1.貴州省腫瘤醫(yī)院，貴州 貴陽 550002;貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550004)

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瘦素對(duì)HepG2細(xì)胞端粒酶及端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的調(diào)控作用研究

曹坤1李海洋2△

(1.貴州省腫瘤醫(yī)院，貴州 貴陽 550002;貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550004)

目的 探討瘦素(leptin)對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2的增殖機(jī)制及對(duì)端粒酶(telomerase，TA)與端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)活性表達(dá)的影響。方法 噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)不同濃度leptin作用不同時(shí)間對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖影響；流式細(xì)胞儀分析其細(xì)胞周期；TRAP-PCR銀染法檢測(cè)不同濃度leptin作用HepG2細(xì)胞后端粒酶的活性；實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白免疫印跡(Western-blot)分析leptin作用24 h后hTERT mRNA及蛋白水平的表達(dá)情況。結(jié)果 leptin可以促進(jìn)HepG2細(xì)胞增殖，具有濃度-時(shí)間依賴性；流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示leptin可以改變HepG2的細(xì)胞周期，使S期比例升高；leptin可以活化HepG2細(xì)胞端粒酶，上調(diào)HepG2 hTERT mRNA及蛋白水平的表達(dá)。結(jié)論 leptin可能通過上調(diào)HepG2 hTERT表達(dá)，增強(qiáng)端粒酶活性，改變肝癌細(xì)胞株HepG2的生物學(xué)行為。

瘦素; HepG2細(xì)胞; 端粒酶; 端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶

肥胖可增加包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤疾病的風(fēng)險(xiǎn),由肥胖基因編碼的瘦素(leptin)在其中起了重要的作用[1-5]。同時(shí)，在永生化的惡性腫瘤細(xì)胞中端粒酶(telomerase，TA)活性升高，而正常組織、癌旁組織以及癌前病變等均不表達(dá)TA活性。因此有學(xué)者認(rèn)為端粒、TA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色，是腫瘤的治療靶點(diǎn)[6-7]。本研究使用leptin體外作用肝癌細(xì)胞株HepG2，觀察leptin對(duì)HepG2細(xì)胞TA與hTETR表達(dá)的影響，并探討相關(guān)機(jī)制。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 leptin購于美國PeproTech公司；人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞由貴州醫(yī)科大學(xué)官志忠教授課題組贈(zèng)送；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購于美國HyClone公司；胎牛血清購于杭州四季青生物制品公司；DNA含量檢測(cè)試劑盒(細(xì)胞周期)、TRAP-PCR銀染法端粒酶檢測(cè)試劑盒購于南京凱基生物技術(shù)有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購于北京康為世紀(jì)生物有限公司；Anti-TERT購于美國ABZOOM公司；hTERT引物由上海生工生物技術(shù)公司合成。hTERT引物序列：上游5’-ggaagagtgtct ggagcaagtt-3’，下游5’-acgtagtccatgttcacaatcg-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)187bp。內(nèi)參β-actin引物序列：上游5’-ctgggacgacatggagaaaa-3’,下游5’-aaggaaggctgg aagagtgc-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)564bp。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 (1)細(xì)胞培養(yǎng):人肝癌細(xì)胞株HepG2用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。(2)MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖：收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，胰酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為10×104/ mL，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，培養(yǎng)12 h后，換為含0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液過夜后加入leptin干預(yù)液。設(shè)置3個(gè)leptin濃度組(40、80、120 ng/mL)，空白對(duì)照組加等體積PBS液，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h(每24 h更換培養(yǎng)基)，向每孔中加入20 μLMTT液(5 g/L)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)。用吸頭吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，置于搖床低速上震蕩10 min，充分溶解結(jié)晶，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光吸收值，以空白孔調(diào)零。(3)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期：將HepG2細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，更換不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液過夜，饑餓細(xì)胞使其同步化后加入不同濃度leptin作用液(0、40、80、120 ng/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞。按照細(xì)胞周期試劑盒使用說明70%預(yù)冷乙醇固定細(xì)胞過夜，4 ℃保存，加入100 μLRNaseA，37 ℃水浴30 min，室溫避光30 min，加入400 μL碘化丙啶(PI)避光染色30 min，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞周期，并用隨機(jī)軟件進(jìn)行分析。(4)TRAP-PCR銀染法端粒酶活性檢測(cè)：按照端粒酶活性檢測(cè)使用說明書操作，收集作用后的HepG2細(xì)胞提取端粒酶，在94 ℃，3 min；94 ℃，30 s；45 ℃，35 s；72 ℃，90 s，5個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸1 min。以上擴(kuò)增結(jié)束后，向各管加入內(nèi)標(biāo)模板1 μL，內(nèi)標(biāo)引物1 μL。繼續(xù)進(jìn)行以下的擴(kuò)增，94 ℃，60 s；94 ℃，40 s；60 ℃，35 s；72 ℃，50 s，35～36個(gè)循環(huán)，72 ℃，延伸10 min。10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，17.5 V/cm，預(yù)跑1～2 h，垂直電泳60 min。銀染，數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)照相分析。(5)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)hTETR-mRNA的表達(dá)：收集作用24 h后的HepG2細(xì)胞，使用TRIZOL法提取細(xì)胞總RNA；cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)采用UltraSYBR Two Step qRT-PCR試劑盒進(jìn)行，PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)，整個(gè)過程收集熒光，反應(yīng)結(jié)束后，檢測(cè)樣本Ct(Threshold cycle)值。β-actin作為內(nèi)參，使用2-△△Ct法確定目標(biāo)基因在mRNA水平的相對(duì)表達(dá)量。計(jì)算△△Ct=(樣品Ct均值-內(nèi)參照Ct均值)-(對(duì)照樣品Ct均值-對(duì)照內(nèi)參照Ct均值)，取2-△△Ct代表樣品目標(biāo)基因mRNA的含量。(6)Western-blot檢測(cè)hTETR蛋白水平表達(dá)：leptin培養(yǎng)基作用HepG2細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，采用細(xì)胞裂解液常規(guī)方法提取蛋白質(zhì)，定量，聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，電轉(zhuǎn)移至NC膜，將膜置于5%脫脂奶粉封閉1 h，用1抗室溫孵育過夜。洗膜3次后2抗孵育2 h，化學(xué)發(fā)光法顯色，曝光，對(duì)蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。β-actin作為內(nèi)參。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞增殖變化 MTT結(jié)果顯示，隨著leptin濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組OD490值較對(duì)照組明顯升高，并呈濃度—時(shí)間依賴性。表明leptin對(duì)HepG2細(xì)胞具有促進(jìn)增殖的作用。leptin濃度為120 ng/mL，作用72 h，增殖作用較對(duì)照組增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而濃度為40 ng/mL作用24 h、72 h的OD490與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表1。

注：與對(duì)照組比較，﹡P<0.05。

圖1 不同濃度leptin作用對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

leptin濃度/(ng/mL)24h48h72h00.46±0.040.56±0.040.70±0.06400.57±0.08 0.62±0.13*0.95±0.1880 0.59±0.08* 0.74±0.18* 0.98±0.16*120 0.62±0.08* 0.77±0.16* 1.00±0.27*

注：與對(duì)照組比較，﹡P<0.05。

2.2 細(xì)胞周期變化 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，隨著leptin濃度的增加，S期比例也隨之升高，G0/G1期則隨著濃度的升高而降低，G2/M期無明顯濃度依賴性，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明leptin可以促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂和DNA的合成，向S期轉(zhuǎn)變。見表2。

leptin濃度/(ng/mL)G0/G1期/%S期/%G2/M期/%0 70.09±2.65 19.84±0.71 10.06±2.76 40 69.80±2.71* 21.10±2.26* 9.10±4.80*80 69.56±4.39* 22.24±2.12* 8.20±2.29*120 66.78±2.32* 24.10±1.47* 8.45±2.44*

注：與對(duì)照組比較，﹡P<0.05。

2.3 Leptin對(duì)HepG2細(xì)胞TA活性的影響 TRAD-PAGE銀染結(jié)果顯示典型的間隔6個(gè)bp的端粒酶梯形條帶，可以看出不同leptin濃度作用HepG2細(xì)胞24 h后的端粒酶活性條帶隨濃度的遞增條帶顏色逐漸變深。見圖2。通過image lab軟件分析其灰度值分別為(20.6±0.67)、(24.87±4.26)、(26.97±0.3)和(30.73±2.86)，具有明顯的濃度依賴性。見圖3。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：1代表對(duì)照組；2、3、4為實(shí)驗(yàn)組分別為40 ng/mL、80 ng/mL、120 ng/mL。

圖2 不同濃度leptin作用對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

注：與對(duì)照組比較，﹡P<0.05。

圖3 端粒酶半定量灰度分析

2.4 Leptin對(duì)HepG2細(xì)胞hTETR表達(dá)的影響 不同濃度leptin作用HepG2細(xì)胞24 h后的mRNA表達(dá)見圖4。結(jié)果顯示與端粒酶活性檢測(cè)結(jié)果一致，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組可以上調(diào)hTERT-mRNA的表達(dá)，隨leptin濃度增加，hTETR的表達(dá)量也隨之升高，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western-blot結(jié)果亦顯示在蛋白水平，leptin上調(diào)hTETR的表達(dá)，并且存在濃度依賴性。見圖5。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

圖4 不同濃度leptin作用對(duì)HepG2

細(xì)胞hTETR mRNA的影響

圖5 不同濃度leptin作用對(duì)HepG2

3 討 論

流行病學(xué)研究[8]結(jié)果顯示,肥胖是癌癥的重要危險(xiǎn)因素，肥胖增加包括原發(fā)性肝細(xì)胞癌在內(nèi)的多種腫瘤疾病如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、食管癌、膀胱癌等的發(fā)病率和死亡率。leptin是由肥胖基因編碼的蛋白質(zhì)類激素，具有調(diào)節(jié)人體代謝等功能。研究發(fā)現(xiàn)[9]原發(fā)性肝癌(hepatocelluar carcinoma,HCC)組織中的leptin和瘦素受體(OB-R)表達(dá)高于癌旁組織、正常組織，但瘦素和OB-R的表達(dá)與患者的腫瘤大小、TNM分期、組織學(xué)分級(jí)、性別、年紀(jì)等因素差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。認(rèn)為leptin和OB-R可能在肝癌組織中雙重表達(dá),在HCC的早期發(fā)生、發(fā)展中起到一定作用。我們檢測(cè)不同濃度leptin作用不同時(shí)間對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖影響，結(jié)果顯示leptin能夠影響肝癌細(xì)胞株HepG2的細(xì)胞周期，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，且存在濃度—時(shí)間依賴性。提示leptin可以作為一種生長(zhǎng)因子對(duì)肝癌有促進(jìn)作用。

正常情況下，生殖細(xì)胞和干細(xì)胞中存在有端粒酶的活性，在其他細(xì)胞中則不能檢測(cè)出端粒酶的活性，而在永生化的惡性腫瘤細(xì)胞中端粒酶則再度活化細(xì)胞可不休止地分裂增殖，比如在肝癌、胃癌、腸癌中可以檢測(cè)到較強(qiáng)的端粒酶活性，但在正常組織、癌旁組織以及癌前病變等均檢測(cè)不到端粒酶活性。因此認(rèn)為腫瘤細(xì)胞的惡性表型的維持需要活化的TA，其中TA的活性又與hTERT密不可分。之前有報(bào)道[10-11]稱TA和hTERT-mRNA的高表達(dá)可能參與了肝臟腫瘤發(fā)生和發(fā)展。Clark等[12]通過對(duì)正常肝組織、慢性病毒性肝炎、肝硬化及HCC患者組織進(jìn)行l(wèi)eptin與hTERT表達(dá)相關(guān)性研究，并證實(shí)leptin表達(dá)與hTERT表達(dá)存在明顯相關(guān)性。我們的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在HepG2細(xì)胞中，leptin能明顯活化TA，隨著leptin濃度的提高，TA活性也隨之增加。TA表達(dá)量與腫瘤的惡性程度存在密切的聯(lián)系，現(xiàn)已證實(shí)在乳腺癌患者中，TA的表達(dá)量與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，活化的TA能明顯降低患者的生存率[13]。而在HCC患者中，TA的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞侵襲也有一定關(guān)系。因此，結(jié)合我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為leptin可能通過激活TA，參與了肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的改變。

hTERT作為TA的限速酶，也被認(rèn)為是一種腫瘤相關(guān)的啟動(dòng)基因，對(duì)TA的活化及肝臟腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起著重要作用。我們使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western-blot檢測(cè)leptin對(duì)HepG2細(xì)胞hTERT表達(dá)的影響，結(jié)果顯示leptin能夠上調(diào)hTERT-mRNA及蛋白水平的表達(dá)。而最近的一些研究發(fā)現(xiàn)，hTERT的功能不僅僅是維持端粒結(jié)構(gòu)。Lee等[14]報(bào)道，hTERT能夠促進(jìn)細(xì)胞的生存，調(diào)控leptin的下游關(guān)鍵基因——細(xì)胞周期蛋白(cyclinD1)和血管內(nèi)皮因子(VEGF)，因此我們認(rèn)為在某種程度上，hTERT可能通過leptin的介導(dǎo)，參與了腫瘤的生長(zhǎng)及血管生成，從而影響腫瘤的生物學(xué)行為。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，leptin能促進(jìn)人肝癌細(xì)胞株HepG2的增殖，增強(qiáng)HepG2細(xì)胞TA的活性，上調(diào)HepG2細(xì)胞hTERT-mRNA及蛋白水平表達(dá)。leptin可能通過調(diào)控端粒酶hTERT來影響肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。因此，阻斷l(xiāng)eptin的信號(hào)系統(tǒng)可能可以作為治療肥胖相關(guān)性腫瘤的治療靶點(diǎn)。

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The biological actions of leptin-induced activity of telomerase and telomerase reverse transcriptase in HepG2

CaoKun，LiHaiyang.

GuizhouCancerHospital，Guiyang550004,Guizhou,China.Correspondingauthor：LiHaiyang，Email：haiyang-li@sina.com.

Objective To analyze the biological actions of leptin-induced activity of telomerase in HepG2 liver cancer cells and provide a new explanation for obesity-related HCC.Methods Effects of different concentrations of leptin (40ng/mL,80 ng/mL,120 ng/mL) on HepG2 were detected with colorimetric assay by Methyl thiazol tetrazoliu(MTT)after incubation periods of 24 h,48 h,and 72 h.Flow cytometry was performed to assess cell cycle progression of different concentrations of leptin as stated above after each 24 h incubation period.Telomerase activity after different concentrations of intervention in HepG2 was assessed using TRAP-silver staining Telomerase Detection Kit.mRNA and protein expression level of hTERT after different concentrations of intervention in HepG2 were assessed using real-time RT-PCR and western blot analysis.Results Leptin could improve the proliferation rate of HepG2 cells.The effect was in does and time-depended partly by MTT method.In the flow cytometry analysis,leptin could promote HepG2 cells entering the S phase from the G0/G1 phase.It was found that leptin activated telomerase in a dose-dependent manner.leptin upregulated the expression of Human Reverse Tanscriptase (hTERT) at mRNA and protein levels.Conclusion Leptin could promote the proliferation of HepG2 cells and promote HepG2 cells entering the S phase from the G0/G1 phase.Leptin is a key regulator of the malignant properties of hepatocellular carcinoma cells through modulation of hTERT,a critical player of oncogenesis.

Leptin； Telomerase； Telomerase reverse transcriptase； Liver cancer cell HepG2

貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(黔科合J字[2011]2235號(hào))

R33;R318;R313

A

1000-744X(2016)12-1242-04

2016-10-20)

△通信作者，E-mail：haiyangli@sina.com