瘦素對HepG2細胞端粒酶及端粒酶反轉錄酶的調控作用研究

曹坤 李海洋

(1.貴州省腫瘤醫(yī)院，貴州 貴陽 550002;貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550004)

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瘦素對HepG2細胞端粒酶及端粒酶反轉錄酶的調控作用研究

曹坤1李海洋2△

(1.貴州省腫瘤醫(yī)院，貴州 貴陽 550002;貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550004)

目的 探討瘦素(leptin)對人肝癌細胞株HepG2的增殖機制及對端粒酶(telomerase，TA)與端粒酶反轉錄酶(hTERT)活性表達的影響。方法 噻唑藍(MTT)比色法檢測不同濃度leptin作用不同時間對HepG2細胞的增殖影響；流式細胞儀分析其細胞周期；TRAP-PCR銀染法檢測不同濃度leptin作用HepG2細胞后端粒酶的活性；實時熒光定量PCR、蛋白免疫印跡(Western-blot)分析leptin作用24 h后hTERT mRNA及蛋白水平的表達情況。結果 leptin可以促進HepG2細胞增殖，具有濃度-時間依賴性；流式細胞儀結果顯示leptin可以改變HepG2的細胞周期，使S期比例升高；leptin可以活化HepG2細胞端粒酶，上調HepG2 hTERT mRNA及蛋白水平的表達。結論 leptin可能通過上調HepG2 hTERT表達，增強端粒酶活性，改變肝癌細胞株HepG2的生物學行為。

瘦素; HepG2細胞; 端粒酶; 端粒酶反轉錄酶

肥胖可增加包括肝癌在內的多種腫瘤疾病的風險,由肥胖基因編碼的瘦素(leptin)在其中起了重要的作用[1-5]。同時，在永生化的惡性腫瘤細胞中端粒酶(telomerase，TA)活性升高，而正常組織、癌旁組織以及癌前病變等均不表達TA活性。因此有學者認為端粒、TA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色，是腫瘤的治療靶點[6-7]。本研究使用leptin體外作用肝癌細胞株HepG2，觀察leptin對HepG2細胞TA與hTETR表達的影響，并探討相關機制。報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 leptin購于美國PeproTech公司；人肝癌細胞株HepG2細胞由貴州醫(yī)科大學官志忠教授課題組贈送；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購于美國HyClone公司；胎牛血清購于杭州四季青生物制品公司；DNA含量檢測試劑盒(細胞周期)、TRAP-PCR銀染法端粒酶檢測試劑盒購于南京凱基生物技術有限公司；實時熒光定量PCR試劑盒購于北京康為世紀生物有限公司；Anti-TERT購于美國ABZOOM公司；hTERT引物由上海生工生物技術公司合成。hTERT引物序列：上游5’-ggaagagtgtct ggagcaagtt-3’，下游5’-acgtagtccatgttcacaatcg-3’，擴增產(chǎn)物長187bp。內參β-actin引物序列：上游5’-ctgggacgacatggagaaaa-3’,下游5’-aaggaaggctgg aagagtgc-3’，擴增產(chǎn)物長564bp。

1.2 實驗方法 (1)細胞培養(yǎng):人肝癌細胞株HepG2用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。(2)MTT比色法檢測細胞增殖：收集對數(shù)期細胞，胰酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調整細胞懸液濃度為10×104/ mL，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，培養(yǎng)12 h后，換為含0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液過夜后加入leptin干預液。設置3個leptin濃度組(40、80、120 ng/mL)，空白對照組加等體積PBS液，每組設5個復孔。分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h(每24 h更換培養(yǎng)基)，向每孔中加入20 μLMTT液(5 g/L)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)。用吸頭吸去孔內培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，置于搖床低速上震蕩10 min，充分溶解結晶，在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm波長處測定各孔光吸收值，以空白孔調零。(3)流式細胞儀分析細胞周期：將HepG2細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，更換不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液過夜，饑餓細胞使其同步化后加入不同濃度leptin作用液(0、40、80、120 ng/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞。按照細胞周期試劑盒使用說明70%預冷乙醇固定細胞過夜，4 ℃保存，加入100 μLRNaseA，37 ℃水浴30 min，室溫避光30 min，加入400 μL碘化丙啶(PI)避光染色30 min，在流式細胞儀上檢測細胞周期，并用隨機軟件進行分析。(4)TRAP-PCR銀染法端粒酶活性檢測：按照端粒酶活性檢測使用說明書操作，收集作用后的HepG2細胞提取端粒酶，在94 ℃，3 min；94 ℃，30 s；45 ℃，35 s；72 ℃，90 s，5個循環(huán)，72 ℃延伸1 min。以上擴增結束后，向各管加入內標模板1 μL，內標引物1 μL。繼續(xù)進行以下的擴增，94 ℃，60 s；94 ℃，40 s；60 ℃，35 s；72 ℃，50 s，35～36個循環(huán)，72 ℃，延伸10 min。10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，17.5 V/cm，預跑1～2 h，垂直電泳60 min。銀染，數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)照相分析。(5)實時熒光定量PCR檢測hTETR-mRNA的表達：收集作用24 h后的HepG2細胞，使用TRIZOL法提取細胞總RNA；cDNA第一鏈合成試劑盒進行逆轉錄。實時熒光定量PCR反應采用UltraSYBR Two Step qRT-PCR試劑盒進行，PCR反應條件如下：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸1 min，共40個循環(huán)，整個過程收集熒光，反應結束后，檢測樣本Ct(Threshold cycle)值。β-actin作為內參，使用2-△△Ct法確定目標基因在mRNA水平的相對表達量。計算△△Ct=(樣品Ct均值-內參照Ct均值)-(對照樣品Ct均值-對照內參照Ct均值)，取2-△△Ct代表樣品目標基因mRNA的含量。(6)Western-blot檢測hTETR蛋白水平表達：leptin培養(yǎng)基作用HepG2細胞24 h后，收集細胞，采用細胞裂解液常規(guī)方法提取蛋白質，定量，聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，電轉移至NC膜，將膜置于5%脫脂奶粉封閉1 h，用1抗室溫孵育過夜。洗膜3次后2抗孵育2 h，化學發(fā)光法顯色，曝光，對蛋白表達進行檢測。β-actin作為內參。

2 結 果

2.1 細胞增殖變化 MTT結果顯示，隨著leptin濃度的增加及作用時間的延長，實驗組OD490值較對照組明顯升高，并呈濃度—時間依賴性。表明leptin對HepG2細胞具有促進增殖的作用。leptin濃度為120 ng/mL，作用72 h，增殖作用較對照組增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而濃度為40 ng/mL作用24 h、72 h的OD490與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1、表1。

注：與對照組比較，﹡P<0.05。

圖1 不同濃度leptin作用對HepG2細胞增殖的影響

leptin濃度/(ng/mL)24h48h72h00.46±0.040.56±0.040.70±0.06400.57±0.08 0.62±0.13*0.95±0.1880 0.59±0.08* 0.74±0.18* 0.98±0.16*120 0.62±0.08* 0.77±0.16* 1.00±0.27*

注：與對照組比較，﹡P<0.05。

2.2 細胞周期變化 流式細胞術結果顯示，隨著leptin濃度的增加，S期比例也隨之升高，G0/G1期則隨著濃度的升高而降低，G2/M期無明顯濃度依賴性，實驗組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明leptin可以促進細胞有絲分裂和DNA的合成，向S期轉變。見表2。

leptin濃度/(ng/mL)G0/G1期/%S期/%G2/M期/%0 70.09±2.65 19.84±0.71 10.06±2.76 40 69.80±2.71* 21.10±2.26* 9.10±4.80*80 69.56±4.39* 22.24±2.12* 8.20±2.29*120 66.78±2.32* 24.10±1.47* 8.45±2.44*

注：與對照組比較，﹡P<0.05。

2.3 Leptin對HepG2細胞TA活性的影響 TRAD-PAGE銀染結果顯示典型的間隔6個bp的端粒酶梯形條帶，可以看出不同leptin濃度作用HepG2細胞24 h后的端粒酶活性條帶隨濃度的遞增條帶顏色逐漸變深。見圖2。通過image lab軟件分析其灰度值分別為(20.6±0.67)、(24.87±4.26)、(26.97±0.3)和(30.73±2.86)，具有明顯的濃度依賴性。見圖3。實驗組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

注：1代表對照組；2、3、4為實驗組分別為40 ng/mL、80 ng/mL、120 ng/mL。

圖2 不同濃度leptin作用對HepG2細胞增殖的影響

注：與對照組比較，﹡P<0.05。

圖3 端粒酶半定量灰度分析

2.4 Leptin對HepG2細胞hTETR表達的影響 不同濃度leptin作用HepG2細胞24 h后的mRNA表達見圖4。結果顯示與端粒酶活性檢測結果一致，實驗組較對照組可以上調hTERT-mRNA的表達，隨leptin濃度增加，hTETR的表達量也隨之升高，實驗組與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Western-blot結果亦顯示在蛋白水平，leptin上調hTETR的表達，并且存在濃度依賴性。見圖5。

注：與對照組比較，*P<0.05。

圖4 不同濃度leptin作用對HepG2

細胞hTETR mRNA的影響

圖5 不同濃度leptin作用對HepG2

3 討 論

流行病學研究[8]結果顯示,肥胖是癌癥的重要危險因素，肥胖增加包括原發(fā)性肝細胞癌在內的多種腫瘤疾病如乳腺癌、子宮內膜癌、食管癌、膀胱癌等的發(fā)病率和死亡率。leptin是由肥胖基因編碼的蛋白質類激素，具有調節(jié)人體代謝等功能。研究發(fā)現(xiàn)[9]原發(fā)性肝癌(hepatocelluar carcinoma,HCC)組織中的leptin和瘦素受體(OB-R)表達高于癌旁組織、正常組織，但瘦素和OB-R的表達與患者的腫瘤大小、TNM分期、組織學分級、性別、年紀等因素差異無統(tǒng)計學意義。認為leptin和OB-R可能在肝癌組織中雙重表達,在HCC的早期發(fā)生、發(fā)展中起到一定作用。我們檢測不同濃度leptin作用不同時間對HepG2細胞的增殖影響，結果顯示leptin能夠影響肝癌細胞株HepG2的細胞周期，具有促進細胞增殖的作用，且存在濃度—時間依賴性。提示leptin可以作為一種生長因子對肝癌有促進作用。

正常情況下，生殖細胞和干細胞中存在有端粒酶的活性，在其他細胞中則不能檢測出端粒酶的活性，而在永生化的惡性腫瘤細胞中端粒酶則再度活化細胞可不休止地分裂增殖，比如在肝癌、胃癌、腸癌中可以檢測到較強的端粒酶活性，但在正常組織、癌旁組織以及癌前病變等均檢測不到端粒酶活性。因此認為腫瘤細胞的惡性表型的維持需要活化的TA，其中TA的活性又與hTERT密不可分。之前有報道[10-11]稱TA和hTERT-mRNA的高表達可能參與了肝臟腫瘤發(fā)生和發(fā)展。Clark等[12]通過對正常肝組織、慢性病毒性肝炎、肝硬化及HCC患者組織進行l(wèi)eptin與hTERT表達相關性研究，并證實leptin表達與hTERT表達存在明顯相關性。我們的實驗研究發(fā)現(xiàn)在HepG2細胞中，leptin能明顯活化TA，隨著leptin濃度的提高，TA活性也隨之增加。TA表達量與腫瘤的惡性程度存在密切的聯(lián)系，現(xiàn)已證實在乳腺癌患者中，TA的表達量與腫瘤大小、淋巴結轉移相關，活化的TA能明顯降低患者的生存率[13]。而在HCC患者中，TA的高表達與腫瘤細胞侵襲也有一定關系。因此，結合我們的實驗結果，認為leptin可能通過激活TA，參與了肝癌細胞生物學行為的改變。

hTERT作為TA的限速酶，也被認為是一種腫瘤相關的啟動基因，對TA的活化及肝臟腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起著重要作用。我們使用實時熒光定量PCR及Western-blot檢測leptin對HepG2細胞hTERT表達的影響，結果顯示leptin能夠上調hTERT-mRNA及蛋白水平的表達。而最近的一些研究發(fā)現(xiàn)，hTERT的功能不僅僅是維持端粒結構。Lee等[14]報道，hTERT能夠促進細胞的生存，調控leptin的下游關鍵基因——細胞周期蛋白(cyclinD1)和血管內皮因子(VEGF)，因此我們認為在某種程度上，hTERT可能通過leptin的介導，參與了腫瘤的生長及血管生成，從而影響腫瘤的生物學行為。

本實驗研究表明，leptin能促進人肝癌細胞株HepG2的增殖，增強HepG2細胞TA的活性，上調HepG2細胞hTERT-mRNA及蛋白水平表達。leptin可能通過調控端粒酶hTERT來影響肝癌細胞的生物學行為。因此，阻斷l(xiāng)eptin的信號系統(tǒng)可能可以作為治療肥胖相關性腫瘤的治療靶點。

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The biological actions of leptin-induced activity of telomerase and telomerase reverse transcriptase in HepG2

CaoKun，LiHaiyang.

GuizhouCancerHospital，Guiyang550004,Guizhou,China.Correspondingauthor：LiHaiyang，Email：haiyang-li@sina.com.

Objective To analyze the biological actions of leptin-induced activity of telomerase in HepG2 liver cancer cells and provide a new explanation for obesity-related HCC.Methods Effects of different concentrations of leptin (40ng/mL,80 ng/mL,120 ng/mL) on HepG2 were detected with colorimetric assay by Methyl thiazol tetrazoliu(MTT)after incubation periods of 24 h,48 h,and 72 h.Flow cytometry was performed to assess cell cycle progression of different concentrations of leptin as stated above after each 24 h incubation period.Telomerase activity after different concentrations of intervention in HepG2 was assessed using TRAP-silver staining Telomerase Detection Kit.mRNA and protein expression level of hTERT after different concentrations of intervention in HepG2 were assessed using real-time RT-PCR and western blot analysis.Results Leptin could improve the proliferation rate of HepG2 cells.The effect was in does and time-depended partly by MTT method.In the flow cytometry analysis,leptin could promote HepG2 cells entering the S phase from the G0/G1 phase.It was found that leptin activated telomerase in a dose-dependent manner.leptin upregulated the expression of Human Reverse Tanscriptase (hTERT) at mRNA and protein levels.Conclusion Leptin could promote the proliferation of HepG2 cells and promote HepG2 cells entering the S phase from the G0/G1 phase.Leptin is a key regulator of the malignant properties of hepatocellular carcinoma cells through modulation of hTERT,a critical player of oncogenesis.

Leptin； Telomerase； Telomerase reverse transcriptase； Liver cancer cell HepG2

貴州省科學技術基金資助項目(黔科合J字[2011]2235號)

R33;R318;R313

A

1000-744X(2016)12-1242-04

2016-10-20)

△通信作者，E-mail：haiyangli@sina.com