掌葉半夏蛋白對肺癌細胞增殖的影響研究*

張明川，趙 剛，舒 暢，石 青

（重慶市銅梁區人民醫院：1.呼吸內科；2.藥劑科402560）

掌葉半夏蛋白對肺癌細胞增殖的影響研究*

張明川1，趙 剛2，舒 暢1，石 青1

（重慶市銅梁區人民醫院：1.呼吸內科；2.藥劑科402560）

目的觀察掌葉半夏蛋白對肺癌細胞增殖的抑制作用。方法將體外培養的對數生長期的人肺癌細胞株A549隨機分為空白對照組、掌葉半夏蛋白組（1.25、5.00、10.00 μg/mL）、陽性對照組（5.00 μg/mL順鉑）。利用四甲基偶氮唑藍比色法測定各組細胞增殖相對抑制率；用流式細胞儀檢測各組細胞周期；采用Western blotting測定B細胞淋巴瘤因子相關X蛋白（Bax）、B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）含量。結果作用24 h后，掌葉半夏蛋白組與陽性對照組吸光度（OD）值均顯著低于空白對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05），且掌葉半夏蛋白組呈劑量依賴性；與空白對照組比較，掌葉半夏蛋白組與陽性對照組在G0～G1期人肺癌細胞株A549細胞明顯增多，而S期人肺癌細胞株A549細胞明顯減少，差異均有統計學意義（P＜0.05），且掌葉半夏蛋白組呈劑量依賴性；掌葉半夏蛋白組與陽性對照組人肺癌細胞株A549細胞中Bax表達水平均顯著高于空白對照組，而Bcl-2、Caspase-3表達水平及Bcl-2/ Bax顯著低于空白對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05），且掌葉半夏蛋白組呈劑量依賴性。結論掌葉半夏蛋白可調節人肺癌細胞株A549抗凋亡/促凋亡因子（Bcl-2/Bax）平衡，從而起到抑制細胞增殖的作用，且呈劑量依賴性。

肺腫瘤； 半夏； 植物蛋白質類； 細胞增殖； 細胞周期

目前，臨床上對于早期肺癌患者常給予手術治療，但是根治者不足30%，而放療與化療在殺死癌癥細胞的同時會損傷正常細胞，不良反應大[1]。中醫認為，肺癌的病因包括邪毒留滯、情志勞倦、飲食內傷等[2]，掌葉半夏，又名獨角蓮、獨腳蓮，味辛、性平，歸肺、肝、脾經，具有燥濕化痰、散結消腫等功效。本研究通過觀察掌葉半夏蛋白對肺癌細胞增殖的抑制作用，探討其可能機制，為肺癌的治療提供方案，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 注射用順鉑購自貴州漢方制藥有限公司（批號：140913）；掌葉半夏蛋白為自制[3]。人肺癌細胞株A549購自中美合資博慧斯生物醫藥科技有限公司，DMEM培養基、胎牛血清、Trizol購于美國Sigma公司。

MinicylerTMPCT-150PCR反應儀購于美國MJ RE-SEARCH公司，HL-2920P酶標自動分析儀、蛋白質電泳和轉移系統購于美國伯樂公司，Du-7HS型紫外分光光度計購自美國貝克曼公司。

1.2 方法

1.2.1 人肺癌細胞株A549培養 在37℃、5%CO2環境下，用含10%胎牛血清、100 μg/L鏈霉素及100 μg/L青霉素的DMEM培養基對人肺癌細胞株A549進行培養，高倍顯微鏡下觀察細胞狀態，當狀態良好時（對數生長期）接種到培養板培養。

1.2.2 四甲基偶氮唑藍（MTT）比色法檢測細胞增殖相對抑制率 將對數生長期的人肺癌細胞株A549分為五組，Ⅰ組為空白對照組[不加藥，加入同等體積二甲基亞砜（DMSO）]；Ⅱ～Ⅳ組為掌葉半夏蛋白組，分別加入不同濃度掌葉半夏提取物（1.25、5.00、10.0 μg/mL）；Ⅴ組作為陽性對照組（5.00 μg/mL順鉑），繼續培養，分別于12、24、48 h后，加入1 mg/mL的MTT工作液，每孔500 μL，在570nm波長下檢測吸光度（OD）值，分析測定掌葉半夏對人肺癌細胞株A549細胞增殖相對抑制率。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞周期 將對數生長期的人肺癌細胞株A549分為五組，Ⅰ組為空白對照組（不加藥，加入同等體積DMSO，Ⅱ～Ⅳ組分別加入不同濃度掌葉半夏提取物（1.25、5.00、10.0 μg/mL），V組作為陽性對照組（加入5.00 μg/mL順鉑），繼續培養3 d后，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，加入50 μg/mL的碘化丙啶進行染色，每孔500 μL，用流式細胞儀檢測，分析細胞周期。

1.2.4 Western blotting測定 Bax、Bcl-2、Caspase-3含量 在培養板中加入Trizol緩沖液1 mL裂解脂肪細胞5 min，然后4℃16 000 r/min離心10 min，收集上清液，采用氯仿、異丙醇、75%乙醇、DEPC水進行總RNA提取。使用RNA凝膠電泳檢測RNA并進行定量。在42℃環境下加入Oligo和M-MLV反轉錄酶合成cDNA第1鏈。聚合酶鏈反應（PCR）擴增特異性cDNA。B細胞淋巴瘤因子相關X蛋白（Bax）cDNA序列上游引物（5′～3′）：CTTTGCCAGCAAACTGGTGC，下游引物（5′～3′）：GAGTCTCACCCAACCACCCT；B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bal-2）cDNA序列上游引物（5′～3′）：CCCTGTGGATGACTGAGTACC，下游引物（5′～3′）：GCCGTACAGTTCCACAAAGG。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）序列上游引物（5′-3′）：GTGAGGCGGTTGTAGAAGAGTT，下游引物（5′-3′）：TCACGGCCTGGGATTTCAAG。PCR擴增后以2%瓊脂糖凝膠電泳，CFX-96數據采集系統拍照進行定量分析。用ECL顯色（南京金斯瑞生物有限公司），β-actin作為對照。

1.3 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析或不配對t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 掌葉半夏蛋白對人肺癌細胞株A549增殖的抑制作用 作用24h后，掌葉半夏蛋白組與陽性對照組OD值均顯著低于空白對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05），并且掌葉半夏蛋白組呈現劑量依賴性：1.25 μg/mL掌葉半夏蛋白組的OD值高于陽性對照組，而10.00 μg/mL掌葉半夏蛋白組的OD值低于陽性對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05），但5.00μg/mL掌葉半夏蛋白組OD值與陽性對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 掌葉半夏蛋白對人肺癌細胞株A549增殖的抑制作用[±s，lg（1/trans）]

表1 掌葉半夏蛋白對人肺癌細胞株A549增殖的抑制作用[±s，lg（1/trans）]

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與陽性對照組比較，bP＜0.05。

組別OD值12 h 24 h 48 h空白對照組掌葉半夏蛋白組1.25 μg/mL 5.00 μg/mL 10.00 μg/mL陽性對照組1.23±0.070.87±0.031.02±0.03 0.79±0.04ab0.53±0.04a0.36±0.02ab0.50±0.05a1.17±0.03 1.12±0.05 1.06±0.04 1.10±0.05 0.64±0.02ab0.42±0.06a0.18±0.03ab0.39±0.04a

2.2 掌葉半夏蛋白對人肺癌細胞株A549細胞周期的影響 與空白對照組比較，掌葉半夏蛋白組與陽性對照組在G0～G1期人肺癌細胞株A549細胞明顯增多，S期人肺癌細胞株A549細胞明顯減少，差異均有統計學意義（P＜0.05），但在G2～M期差異無統計學意義（P＞0.05）；掌葉半夏蛋白組呈現劑量依賴性：1.25 μg/mL掌葉半夏蛋白組人肺癌細胞株A549細胞在G0～G1期少于陽性對照組，在S期多于陽性對照組，而10.00 μg/mL掌葉半夏蛋白組人肺癌細胞在G0～G1期多于陽性對照組，在S期少于陽性對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05），但5.00 μg/mL掌葉半夏蛋白組人肺癌細胞株A549細胞在G0～G1與S期與陽性對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 掌葉半夏蛋白對人肺癌細胞株A549細胞周期的影響[±s，lg（1/trans）]

表2 掌葉半夏蛋白對人肺癌細胞株A549細胞周期的影響[±s，lg（1/trans）]

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與陽性對照組比較，bP＜0.05。

組別G0～G1 G2～M S空白對照組掌葉半夏蛋白組1.25 μg/mL 5.00 μg/mL 10.00 μg/mL陽性對照組52.10±3.8216.20±1.9830.50±2.43 57.80±4.15ab62.50±4.47a69.80±4.29ab61.80±4.30a16.40±1.15 15.30±0.76 14.90±0.68 15.20±0.82 26.90±2.06ab24.30±1.45a20.90±1.02ab23.50±1.61a

2.3 掌葉半夏蛋白對人肺癌細胞株A549中Bax、Bcl-2、Caspase-3表達的影響 掌葉半夏蛋白組與陽性對照組人肺癌細胞株A549細胞中Bax表達水平顯著高于空白對照組，而Bcl-2、Caspase-3表達水平及Bcl-2/Bax均顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；掌葉半夏蛋白組呈劑量依賴性：1.25 μg/mL掌葉半夏蛋白組Bax表達水平低于陽性對照組，Bcl-2、Caspase-3表達水平及Bcl-2/Bax高于陽性對照組，而10.00 μg/mL掌葉半夏蛋白組Bax表達水平高于陽性對照組，Bcl-2、Caspase-3表達水平及Bcl-2/Bax低于陽性對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05），但5.00 μg/mL半夏蛋白組上述指標與陽性對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 掌葉半夏蛋白對人肺癌細胞株A549中Bax、Bcl-2、Caspase-3表達的影響[±s，lg（1/trans）]

表3 掌葉半夏蛋白對人肺癌細胞株A549中Bax、Bcl-2、Caspase-3表達的影響[±s，lg（1/trans）]

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與陽性對照組比較，bP＜0.05。

組別Bax Bcl-2 Bcl-2/Bax Caspase-3空白對照組掌葉半夏蛋白組1.25 μg/mL 5.00 μg/mL 10.00 μg/mL陽性對照組162.00±10.90129.00±12.303.65±0.230.80±0.11 181.00±13.70ab189.00±14.90a194.00±16.50ab191.00±15.20a123.00±9.84ab109.00±7.49a101.00±8.01ab108.00±7.25a2.48±0.19ab1.95±0.18a1.73±0.15ab1.86±0.20a0.68±0.09ab0.57±0.10a0.49±0.08ab0.56±0.11a

3 討 論

肺癌是由多基因損傷變異、不良生活習慣、職業暴露（砷、鎳、煤焦油等）、空氣污染等多種因素導致的、發生于支氣管黏膜上皮的肺原發性惡性腫瘤，流行病學調查顯示，肺癌在我國人群中的發病率為48/10萬～53/10萬，2013年因肺癌死亡人數居惡性腫瘤首位[4]。對于肺癌患者西醫主要采用手術切除病灶（早、中期肺癌）或放療與化療抑制癌細胞增殖轉移達到治療肺癌的目的。但有研究表明，手術、放療和化療等西醫治療方法在清除、縮小腫瘤細胞的同時，也會對機體免疫系統造成影響，患者常因免疫功能損害而中斷治療[5]。隨著中醫藥事業的發展，中藥由于療效確切、不良反應小等優點被逐漸應用于臨床疾病治療。中醫認為，肺癌歸屬于“咯血”、“肺巖”、“胸痛”等范疇，將中藥用于肺癌治療[6-7]，可以通過抑制肺癌細胞增殖、誘導分化凋亡及完善免疫功能、加速體力恢復2個方面發揮治療效果。掌葉半夏為天南星科植物掌葉半夏Rhizoma Pinelliae Pedatiseatae的干燥塊莖，大量研究證實，掌葉半夏提取物能夠調控宮頸癌細胞株HPVE6基因、p53基因的表達，抑制細胞增殖，且具有抗腫瘤、免疫作用[8-10]，掌葉半夏屬于在肺癌治療中使用頻率最高的化痰藥范疇，但是臨床上對于其在對肺癌細胞的作用鮮有報道。

本研究選取人肺癌細胞株A549作為研究對象，觀察掌葉半夏蛋白對肺癌細胞增殖的抑制作用，發現掌葉半夏蛋白作用24 h后對人肺癌細胞株A549增殖的抑制作用最佳，能夠顯著抑制細胞增殖，且呈現劑量依賴性。此外，本研究發現掌葉半夏蛋白組與陽性對照組在G0～G1期人肺癌細胞株A549細胞明顯增多，而S期人肺癌細胞株A549細胞明顯減少，差異均有統計學意義（P＜0.05），提示掌葉半夏蛋白能夠使細胞增殖速度減慢。有研究表明，Bcl-2基因家族、Her2/neu基因、MYC基因在肺癌發生中發揮重要作用，其中促凋亡的Bax與抗凋亡的Bcl-2是Bcl-2基因家族的重要成員，Bax/Bcl-2比值與癌癥細胞凋亡密切相關，而Caspase-3被稱為“死亡蛋白酶”，在凋亡信號傳導途徑中發揮重要作用。本研究中掌葉半夏蛋白組與陽性對照組人肺癌細胞株A549細胞中Bax表達量顯著高于空白對照組，而Bcl-2、Caspase-3表達量及Bcl-2/Bax顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05），且掌葉半夏蛋白組呈劑量依賴性，提示掌葉半夏通過調控Bax、Bcl-2、Caspase-3表達發揮抗腫瘤作用。但是，掌葉半夏中的凝集素蛋白及毒針晶具有毒性[11-12]，會對正常細胞造成損傷。本研究僅針對腫瘤細胞抑制作用進行分析，未對正常細胞損害進行探討，臨床上應進行深入研究以提高其使用價值。

綜上所述，掌葉半夏蛋白通過調控Bax、Bcl-2、Caspase-3表達抑制肺癌細胞增殖，發揮抗腫瘤作用。

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Study on effect of Pinellia pedatisecta Schott protein on proliferation of lung cancer cells*

Zhang Mingchuan1，Zhao Gang2，Shu Chang1，Shi Qing1
（1.Department of Respiration；2.Department of Pharmacy，Tongliang District People′s Hospital of Chongqing 402560，China）

ObjectiveTo observe the inhibitory effect of Pinellia pedatisecta Schott protein on the proliferation of lung cancer cells.MethodsCultured human lung cancer cell line A549 in vitro at logarithmic growth phase were randomly divided into the blank control group，Pinellia pedatisecta Schott protein groups（1.25，5.00，10.00 g/mL）and positive control group（cisplatin 5.00 g/mL）.The relative inhibition rate of cell proliferation in each group was measured by MTT colorimetric method；the cell cycle was detected by flow cytometry；the contents of Caspase-3，Bcl-2 and Bax were determined by Western blotting.ResultsThe optical density（OD）value after 24 h action in the Pinellia pedatisecta Schott protein group and positive control group was significantly lower than that in the blank control group，the difference was statistically significant（P＜0.05），moreover the Pinellia pedatisecta Schott protein group showed a dose-dependent manner;compared with the blank control group，human lung cancer cell line A549 cells at stage G0～G1in the Pinellia pedatisecta Schott protein group and positive control group were significantly increased，while which at the stage S were significantly decreased，the differences were statistically significant（P＜0.05），moreover the Pinellia pedatisecta Schott protein group showed a dose-dependent manner；the Bax expression level of human lung cancer cell line A549 cells in the Pinellia pedatisecta Schott protein group and positive control group was significantly higher than that in the blank control group，while Bcl-2 and Caspase-3expression levels and Bcl-2/Bax were significantly lower than those in the control group，the differences were statistically significant（P＜0.05），moreover the Pinellia pediatisecta Schott protein group showed a dosedependent manner.ConclusionPinellia pedatisecta Schott protein can regulate the anti-apoptosis/pro-apoptosis factors（Bcl-2/ Bax）balance of human lung cancer cell line A549，thus plays the effect for inhibiting the cellular proliferation，moreover with a dose-dependent manner.

Lung neoplasms； Pinellia ternate； Plant proteins； Cell proliferation； Cell cycle

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.24.007

：A

：1009-5519（2016）24-3760-03

2016-11-15）

重慶市銅梁區科委2014年醫療衛生類社會事業科技資助項目（201405）。

張明川（1977-），碩士研究生，副主任醫師，主要從事肺癌早期診斷及慢性氣道炎癥性疾病的防治研究。