大麻素受體1基因多態性和腸易激綜合征的關系

李 潔 黎鐘燕 辜金蓮 張 龍

廣州市第一人民醫院老年病科，廣東廣州 510180

大麻素受體1基因多態性和腸易激綜合征的關系

李 潔 黎鐘燕 辜金蓮 張 龍

廣州市第一人民醫院老年病科，廣東廣州 510180

目的探討大麻素受體1基因（CNR1）多態性和腸易激綜合征的關系。方法選取2014年9月～2016年9月我院消化內科及老年病科收治的60例腸易激綜合征患者及同期體檢的60例健康患者作為研究對象，60例腸易激綜合征患者作為觀察組，同期體檢的60例健康患者作為對照組，采用PCR技術擴增血清標本中的基因組DNA，并對其進行順序的測定，比較兩組患者常見等位基因及基因型情況，進而對CNR1的多態性和腸易激綜合征的關系進行分析。結果對基因組DNA擴增的目標片段進行順序的測定共發現8種CNR1等位基因和20種基因型，研究對象中出現頻率最高的等位基因為AAT13，最常見的基因型是13/13，觀察組患者AAT13及13/13基因型出現的頻率分別為51.67%和33.33%，與對照組（33.33%、16.67%）相比明顯要高；初步得到一定結果后，以等位基因AAT10分界，觀察組患者等位基因AAT≥10（96.67%）及基因型為≥10/≥10出現的頻率（93.33%）顯著高于對照組患者等位基因AAT≥10（83.33%）及基因型為≥10/≥10出現的頻率（80.00%），差異有統計學意義（P＜0.05）。結論腸易激綜合征患者CNR1基因的等位基因頻率出現最高的為AAT13，其最廣泛的基因型為13/13，CNR1基因型的多態性和腸易激綜合征的發生存在一些聯系，對于擁有≥10等位基因及基因型為≥10/≥10的人群更易患腸易激綜合征，這對腸易激綜合征早期診斷具有極為重要的臨床意義。

大麻素受體1基因；基因多態性；等位基因；基因型；腸易激綜合征

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）為一種與胃腸功能改變有關的疾病，臨床表現多為慢性或復發性腹痛、腹瀉，腸易激綜合征患者排便習慣和大便性狀均異于正常人群，在發病后較容易鑒別[1]。近年來，基因研究發現腸易激綜合征患者的大麻素受體1基因與健康人群相比具有一定差異性，該項研究的發現為腸易激綜合征的早發現、早診斷、早治療提供了極高的臨床參考價值[2-3]。因此，我院為進一步探討分析大麻素受體1基因（CNR1）多態性和腸易激綜合征的關系，特選取2014年9月～2016年9月我院消化內科及老年病科收治的60例腸易激綜合征患者及同期體檢的60例健康患者作為研究對象，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將2014年9月～2016年9月我院消化內科及老年病科收治的60例腸易激綜合征患者及同期體檢的60例健康人作為研究對象，其中男55例，女65例，年齡38～85歲，平均（45.4±13.4）歲。60例腸易激綜合征患者作為觀察組，同期體檢的60例健康人作為對照組，觀察組男27例，女33例，年齡39～83歲，平均（44.9±14.1）歲，體重60～79kg，平均（69.70±15.18）kg；腸易激綜合征類型分類：便秘型腸易激綜合征17例，腹瀉型腸易激綜合征19例，混合型腸易激綜合征24例。對照組男38例，女32例，年齡38～85歲，平均（45.4±13.0）歲，體重59～81kg，平均（70.28±18.32）kg。兩組患者的年齡、性別、體重等情況差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。兩組間研究對象的年齡、性別、體重及疾病類型等情況差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。診斷標準：根據羅馬Ⅲ診斷標準：出現癥狀至少6個月，且近3個月病情活動，表現為反復發作性腹痛或腹部不適，在最近3個月，＞3天/月，排便后疼痛和不適可改善，發作時伴有排便次數和（或）大便性狀改變。納入標準：（1）符合羅馬Ⅲ診斷標準，且經實驗室及鋇餐、X射線等輔助檢查確診為腸易激綜合征；（2）患者意識清楚、神智正常，能對事物進行清晰的表達；（3）能主動配合調查，各項生命體征平穩；（4）本組研究經倫理委員會批準后實施，本人及家屬對本組治療方案均已詳細了解，并主動簽署知情同意書，患者的臨床資料均不公開，充分尊重患者的隱私性。排除標準：（1）全身感染、其他全身性疾病的患者；（2）心、肝、腎功能嚴重損、精神異常的患者；（3）甲亢、糖尿病、子宮肌瘤、膽囊結石等疾病的患者；（4）不愿參加本研究者。

1.2 方法

取所有研究對象2mL靜脈血，經EDTA抗凝后30min，離心加速分離血液標本中的血漿和血細胞，離心速度定在3000r/min，時間為5min，經分離后將離心的血液標本置于-84℃的冰箱中為進一步檢測大麻素受體1基因做前期準備；采用美國QIAGEN公司QIamp DNA Blood MiniKi試劑盒提取基因組DNA，生產批號201308132。一切準備就緒后，采用聚合酶鏈式反應技術（PCR）擴增基因組DNA：（1）模板DNA經加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做準備；（2）模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；（3）DNA模板--引物結合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。然后采用2%的瓊脂糖凝膠（西安藍曉科技新材料股份有限公司， LXROSE-20160318）電泳檢測基因組DNA擴增的目標片段，并對其進行順序的測定，計數CNR1基因3`側翼區存在的AAT重復序列而進行CNR1基因多態性的分析與研究。將PCR擴增產物送至上海英俊公司測序，記錄基因翼區擴增片段的AAT三聯重復序列個數進行基因型分析，首先對兩組患者常見等位基因及基因型情況進行評估分析，初步得到一定結果后，以等位基因AAT10分界，比較兩組患者等位基因AAT≥10及基因型為≥10/≥10之間的差異。

1.3 觀察指標

比較兩組患者常見等位基因及基因型情況，對基因組DNA擴增的目標片段進行順序的測定，分析研究對象中出現頻率最高的等位基因及最常見的基因型，并比較兩組患者的差異。初步得到一定結果后，以等位基因AAT10分界，比較兩組患者等位基因AAT≥10及基因型為≥10/≥10之間的差異。

1.4 統計學處理

以Hardy-Weinberg平衡檢驗樣本的群體代表性，以保證本研究中各對象基因頻率已達到了遺傳學上的平衡。統計分析時采用SPSS17.0統計軟件進行分析，荃因型和等位基因片段以百分比表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基因頻率遺傳學上平衡情況

對所有研究對象應用Hardy-Weinberg平衡檢驗后，確定所有樣本具有群體代表性，本研究中各對象基因頻率已達到了遺傳學上的平衡，能夠進行進一步的實驗與研究。

2.2 兩組患者常見等位基因及基因型情況比較

對基因組DNA擴增的目標片段進行順序的測定共發現8種CNR1等位基因和20種基因型，8種CNR1等位基因中出現頻率最高的等位基因為AAT13，20種基因型中最常見的基因型是13/13。觀察組患者AAT13及13/13基因型出現的頻率分別為51.67%和33.33%，與對照組（33.33%、16.67%）相比明顯要高，初步說明CNR1的多態性和腸易激綜合征的發生具有一定相關性。見表1。

表1 兩組患者常見等位基因及基因型情況的比較[n（%）]

2.3 兩組患者等位基因AAT≥10及基因型為≥10/≥10的情況

初步得到一定結果后,以等位基因AAT10分界,觀察組患者等位基因AAT≥10出現的頻率（96.67%）及基因型為≥10/≥10出現的頻率（93.33%）顯著高于對照組患者等位基因AAT≥10出現的頻率（83.33%）及基因型為≥10/≥10出現的頻率（80.00%）,差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組患者等位基因AAT≥10及基因型為≥10/≥10之間的差異[n（%）]

3 討論

腸道易激綜合征是一種常見的腸道功能紊亂性疾病，中青年女性發病較多[4]。隨著現代快節奏的生活，加之人們飲食習慣的改變，腸道易激綜合征的發病率逐年攀升，對其盡快的診斷與治療對提高患者日常生活質量有著極高的臨床應用價值[5]。腸易激綜合征根據“羅馬Ⅲ診斷標準”可分為便秘型腸易激綜合征、腹瀉型腸易激綜合征及混合型腸易激綜合征三類，臨床主要表現為腹痛和排便異常，缺乏形態學、微生物學和生化學異常[6-7]。反復的腹痛、腹瀉及便秘給患者日常生活與工作帶來了極大的不便[8]。另外，該病癥確切病因尚不清楚，這就給臨床上提高評估腸道易激綜合征發病可能性帶來了很大的不便。

本研究在近年各位學者研究的基礎上，從靜脈血標本基因入手，經EDTA抗凝后30min，進行離心分離對目標基因采用PCR技術擴增基因組DNA，并對其進行順序的測定，計數CNR1基因3`側翼區存在的AAT重復序列而進行CNR1基因多態性的分析與研究。研究結果顯示，研究對象中出現頻率最高的等位基因為AAT13，最常見的基因型是13/13，觀察組患者AAT13及13/13基因型出現的頻率與對照組相比明顯要高，初步說明CNR1的多態性和腸易激綜合征的發生具有一定相關性[9]。CNR1是參與大麻素系統生理病理的重要物質，大麻素受體有兩種亞型：CNR1和CNR2[10]。研究發現[11]，敲除小鼠CNR1基因后，可使其血中胰島素與瘦素水平降低，并改善胰島素和瘦素抵抗，表明CNR1在飲食誘導及腸道功能方面起這十分重要的作用，且與機體能量的消耗密切相關。CNR1基因存在基因多態性，CNR1基因3`側翼區存在的AAT重復序列是造成基因多態性的主要原因，AAT重復序列可在DNA內部形成Z型結構，從而影響DNA轉錄，導致AAT重復序列對的DNA轉錄收到影響，最終影響大麻素正常功能的發揮[12]。可見，對CNR1基因多態性的研究具有十分重要的臨床意義，提示臨床上可以采用模擬DNA的轉錄，達到治療腸易激綜合征的目的，進而提高患者生活質量[13]。

本研究初步得到出現頻率最高的等位基因為AAT13，最常見的基因型是13/13這一結果后，以等位基因AAT10分界，觀察組患者等位基因AAT≥10及基因型為≥10/≥10出現的頻率與對照組相比明顯要高，差異有統計學意義（P＜0.05）。可見，對于擁有≥10等位基因及基因型為≥10/≥10的人群更易患腸易激綜合征，這對腸易激綜合征早期診斷具有極為重要的臨床意義，在臨床早期診斷過程中，臨床工作人員可以通過患者血清離心分離后對基因組進行研究，根據其等位基因及基因型出現的頻率評估該患者是否為腸易激綜合征易感人群，對于易感人群即可進行進一步有針對性的診斷與治療，這不但減少了臨床工作的繁瑣性，還能夠有效提高腸易激綜合征患者診斷的準確性[14]。另外，腸易激綜合征以中青年女性為高發人群，對CNR1多態性研究還可以細化到性別之間的等位基因及基因型出現頻率的比較，以便進一步評估不同性別患者不同基因表達類型患腸易激綜合征的幾率，為臨床早期的診斷及治療提供有說服力的診斷依據[15]。

綜上所述，腸易激綜合征患者CNR1基因的等位基因頻率出現最高的為AAT13，其最廣泛的基因型為13/13，CNR1基因型的多態性和腸易激綜合征的發生存在一些聯系，對于擁有≥10等位基因及基因型為≥10/≥10的人群更易患腸易激綜合征，這對腸易激綜合征早期診斷具有極為重要的臨床意義。

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Relationship between cannabinoid receptor 1 gene polymorphism and irritable bowel syndrome

LI Jie LI Zhongyan GU Jinlian ZHANG Long
Department of Geriatrics,Guangzhou First People's Hospital,Guangzhou 510180,China

ObjectiveTo investigate the relationship between cannabinoid receptor 1 gene （CNR1） polymorphism and irritable bowel syndrome.Methods60 cases of patients with irritable bowel syndrome cured in GI medicine and geriatrics department of our hospital from September 2014 to September 2016 and 60 cases of healthy patients were selected as the research objects.The 60 cases of patient with irritable bowel syndrome were selected as observation group,the 60 cases of patients of health examination during the same period were selected as control group.PCR technology were used to amplify the genomic DNA in serum samples,and its sequence was determined. Common alleles and genotypes of the two groups were compared,and the relationship between CNR1 polymorphism and irritable bowel syndrome were analyzed.ResultsThe genomic DNA amplification of the target fragment sequence determination revealed that there were 8 CNR1 alleles and 20 genotypes.The research object in the highest frequency of the allele was AAT13,the most common genotype was 13/13.The frequencies of AAT13 and 13/13 genotypes in the observation group were 51.67% and 33.33% respectively,which were significantly higher than the control group（33.33%,16.67%）. Some preliminary results,with division of allele AAT10 boundaries,the frequency of allele AAT≥10 （96.67%） and genotype frequency≥10/≥10（93.33%）in observation group were significantly higher than that in control group with allele AAT≥10（83.33%）and genotype frequency≥10/≥10（80%）,with statistically significant(P＜0.05).ConclusionThe patients with irritable bowel syndrome CNR1 gene allele frequency is the highest in AAT13,and the most widely is genotype 13/13.CNR1 genotype polymorphism and irritable bowel syndrome occurred in the presence of some contact with≥ 10 alleles and genotypes≥ 10/≥ 10 people are more likely to suffer from irritable bowel syndrome,and the irritable bowel syndrome early diagnosis has important clinical significance.

Cannabinoid receptor 1 gene;Gene polymorphism;Allele;Genotype;Irritable bowel syndrome

R574.4

2016-08-19）