循環(huán)腫瘤細胞在肺癌中的應(yīng)用

畢向雁 劉苓霜 姜怡 沈麗萍

循環(huán)腫瘤細胞在肺癌中的應(yīng)用

畢向雁 劉苓霜 姜怡 沈麗萍

循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）是指從實體瘤或轉(zhuǎn)移灶脫落后釋放進入外周血中的腫瘤細胞，CTCs檢測與肺癌早期診斷、臨床分期、預(yù)后評估有著密切的關(guān)系，對延長肺癌患者生存有重要作用。本文就CTCs檢測技術(shù)以及其在肺癌中的應(yīng)用進行綜述。

肺癌循環(huán)腫瘤細胞分期療效評價

美國癌癥協(xié)會最新數(shù)據(jù)顯示2017年肺癌死亡率在惡性腫瘤中居首位，即使接受了根治性手術(shù)的早期肺癌患者，也有45%在8～18個月內(nèi)會出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[1]，晚期肺癌患者5年生存率僅為4%[2]，轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤一大生物學(xué)特征。血中循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）的出現(xiàn)是發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的前提[3]，是形成轉(zhuǎn)移灶的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4]，因此檢測外周血中CTCs對肺癌早期診斷、臨床分期、療效評價、基因檢測具有重要意義。由于CTCs的檢測較常規(guī)診斷手段如組織活檢、放射檢查等損傷小，更為敏感[5]，近年來對其檢測及臨床應(yīng)用價值的探索成為研究熱點。本文就CTCs檢測技術(shù)以及其在肺癌中的應(yīng)用進行綜述。

1 CTCs概述

Ashworth在1869年通過顯微鏡觀察到腫瘤患者血液中存在CTCs[6]?；贏shworth的研究，1889年英國病理學(xué)家Paget提出了腫瘤學(xué)界著名的種子和土壤假說，成功地闡釋了癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的機制。目前CTCs定義為由實體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞。隨著腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，部分腫瘤細胞出現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT），使腫瘤細胞的運動能力增強，極易侵入結(jié)締組織間隙而進入血液循環(huán)系統(tǒng)，或者隨著腫瘤擴張生長，毛細血管破裂，直接進入血液系統(tǒng)，形成CTCs[7]。進入血液循環(huán)的CTCs存在異質(zhì)性，會受到自身免疫系統(tǒng)的排斥，最終僅有不足0.01%的CTCs能夠存活[8]。這些逃過免疫反應(yīng)的CTCs再通過間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（mesenchymal-to-epithelial transition，MET）重新獲得上皮表型，突破血管屏障，從而形成轉(zhuǎn)移灶。因此，若在患者外周血檢測出CTCs便可以作為肺癌診斷及發(fā)生轉(zhuǎn)移的證據(jù)。

2 CTCs的富集方法

富集方法分為非特異性富集方法和特異性富集方法，常用的非特異性富集方法有：（1）密度梯度離心法，該方法操作簡便，但價格昂貴，血液需要量大，靈敏度低，重復(fù)性較差，且CTCs可能遷入紅細胞層造成丟失現(xiàn)象。（2）膜過濾法，此方法簡單、經(jīng)濟，缺點在于一些較大的單核細胞容易與腫瘤細胞混在一起，而一些較小的CTCs也容易被濾過而造成丟失，因此缺乏較高的敏感度及特異度。常見的特異性富集方法為免疫磁珠富集法，陽性富集技術(shù)適用于抗上皮細胞黏附因子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）或抗細胞角蛋白（cytokeratin，CK）陽性的CTCs，陰性富集技術(shù)優(yōu)勢在于可以檢出Ep－CAM或CK陰性的CTCs，能夠避免腫瘤細胞發(fā)生EMT而導(dǎo)致CTCs陽性率的降低,也可將兩種模式結(jié)合，既可保證靶細胞形態(tài)和功能的完整，又可提高富集效率，以便下一步檢測。

3 CTCs的檢測方法

CTCs的檢測方法主要有：（1）免疫細胞化學(xué)法（ICC），該方法可以進行細胞大小和形態(tài)學(xué)的分析，但靈敏度低，難以滿足臨床診斷的需要。（2）逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR），該技術(shù)靈敏度高，但易受外界環(huán)境的影響，出現(xiàn)假陽性。同時，由于破壞了細胞結(jié)構(gòu)，無法對CTCs進行后續(xù)計數(shù)及細胞形態(tài)方面進行分析。（3）酶聯(lián)免疫斑點法（ELISPOT），這種方法只能識別活細胞，因為只有活細胞才能夠分泌足夠的蛋白。（4）配體靶向PCR法（LT-PCR），該方法是目前最新的國內(nèi)原創(chuàng)CTCs檢測技術(shù)，其原理是肺癌等CTCs表面會過量表達某些特異性受體，如葉酸受體（FR），通過細胞表面特異性受體與其配體類似物的結(jié)合來實現(xiàn)探針與CTCs細胞的結(jié)合，并且通過對探針的PCR定量檢測來計算CTCs的數(shù)目。FR的表達具有很強的組織和腫瘤特異性，因此，配體介導(dǎo)的靶向PCR法，具有高度靈敏度，從而使CTCs能夠探測早期肺癌。

4 CTCs在肺癌中的臨床應(yīng)用

4.1 輔助診斷目前肺癌診斷主要依賴影像學(xué)或病理學(xué)檢查結(jié)果，對于反映腫瘤細胞微轉(zhuǎn)移有一定難度，隨著CTCs在肺癌診斷中應(yīng)用價值研究的開展，越來越多的學(xué)者認為外周血CTCs檢測可作為一種非侵入性的“液體病理”[9－13]。

Ilie等[14]檢測無臨床腫瘤證據(jù)的慢性阻塞性肺?。–OPD）患者血液中的CTCs，有3%的患者檢測到了CTCs，并且CTCs陽性者在接下來的1～4年內(nèi)出現(xiàn)了肺結(jié)節(jié)，且手術(shù)證實為早期肺癌。Kurusu等[15]利用CellSearch技術(shù)富集分離125例肺癌患者和25例肺良性腫瘤患者外周血中的CTCs（以1個CTC/7.5ml為閾值），發(fā)現(xiàn)125例肺癌患者CTCs陽性率為30.6%，明顯高于良性腫瘤患者的12.0%（P＜0.05）。Hoffman等[16]通過檢測發(fā)現(xiàn)惡性疾病患者、不確定惡性疾病患者及良性疾病患者CTCs陽性率分別為83%、12%和5%，而作為陰性對照組的59例健康患者中則沒有檢測到CTCs。中位隨訪24個月后發(fā)現(xiàn)，CTCs 50個/10ml的肺癌患者術(shù)后無病生存期（DFS）和總生存期（OS）相較于CTCs＜50個/10ml的肺癌患者短，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001、0.002）。Ross等[17]檢測49例肺癌患者和20名健康者外周血中的CTCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在健康者中未檢測出CTCs，而肺癌組均檢測到CTCs，其中5例Ⅰ期患者檢測出CTCs，數(shù)值為（0.40±0.55）個，可見CTCs對肺癌診斷有幫助。

Yu等[18]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)閾值設(shè)定為8.64/3ml時，CTCs診斷肺癌的靈敏度為72.3%，特異度為84.1%，其診斷效能明顯高于神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、癌胚抗原（CEA）、糖類抗原125（CA125）、細胞角蛋白片段抗原211（CYFRA211）及鱗狀細胞癌相關(guān)抗原（SCCAg）[19]等腫瘤標(biāo)志物。Chen等[20]通過檢測發(fā)現(xiàn)在肺鱗癌患者血中SCCAg水平與CTCs數(shù)呈正相關(guān)，因此認為兩者聯(lián)合檢測可提高早期肺癌的診斷率。Chen等[21]發(fā)現(xiàn)CTCs在鑒別肺部良惡性病變方面特異度高達88.65%，高于CEA、NSE、CYFRA211等常用腫瘤標(biāo)志物特異度（82.39%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），上述研究均表明CTCs與常見腫瘤標(biāo)志物相比在肺癌的診斷上具有一定的優(yōu)勢。

4.2 分期相關(guān)性臨床分期是制定肺癌治療方案的主要依據(jù)，最新研究結(jié)果顯示肺癌CTCs與腫瘤分期具有明顯的相關(guān)性，且能顯示腫瘤細胞增殖過程中的變異[22]。

Mascalchi等[23]在26例確診為Ⅲ～Ⅳ期肺癌患者的外周血中檢測到CTCs 17例（65%），計數(shù)為（6.8±3.7）個/3ml。Zhao等[24]將外周血中CTCs計數(shù)2個/3.2ml定義為CTCs陽性，檢測35例根治術(shù)后肺癌患者的CTCs，結(jié)果顯示：CTCs陽性率Ⅰ期7.7%（1/13），Ⅱ期33.3%（2/6），Ⅲ期43.8%（7/16），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果表明CTCs陽性率與肺癌術(shù)后分期之間關(guān)系密切。Lou等[25]用LT-PCR法檢測72例肺癌患者外周血中的CTCs：閾值設(shè)置為8.5個/3ml，Ⅰ、Ⅱ期癌癥陽性率80%，Ⅲ期陽性率67%，Ⅳ期陽性率高達93%。Liu等[26]檢測65例肺癌患者的CTCs，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性肺癌患者CTCs的陽性率為83.33%，明顯高于非轉(zhuǎn)移性患者的43.48%，且隨著轉(zhuǎn)移部位個數(shù)的增多，CTCs的陽性率逐漸上升。Jia等[27]將113例入組人員分為肺癌組（50例）、良性腫瘤組（35例）和正常對照組（28例），發(fā)現(xiàn)CTCs計數(shù)在肺癌組明顯高于良性腫瘤組和正常對照組，且CTCs計數(shù)在肺癌中與臨床分期密切相關(guān)（P＜0.01）。有兩項薈萃分析結(jié)果示：基線狀態(tài)、治療后外周血中存在CTCs的患者預(yù)后效果不佳，而且分期越晚，越易檢測到CTCs，提示CTCs的檢出率與患者分期密切相關(guān)[28-29]。

4.3 療效評價有研究表明，CTCs在外周血中的水平與肺癌患者預(yù)后具有顯著相關(guān)性[30]，因此通過實時檢測CTCs的數(shù)目和分子特性可以反映病情變化，有助于指導(dǎo)個體化治療，及時調(diào)整治療方案。

Hirose等[31]評估了33例接受吉西他濱聯(lián)合卡鉑化療的轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌（NSCLC）患者CTCs計數(shù)變化與化療療效之間的相關(guān)性，結(jié)果提示：化療后CTCs陽性1個/7.5ml的患者中出現(xiàn)腫瘤進展的比例為66.7%，顯著高于CTCs陰性者的23.8%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.02）。Punnoose等[32]將化療前后PET-CT結(jié)果與CTCs檢測水平相比較，提示CTCs檢測結(jié)果與PET-CT療效評價結(jié)果相吻合。Hou等[33]研究發(fā)現(xiàn)化療前后CTCs的變化對肺癌患者的PFS及OS有較強預(yù)測作用，CTCs數(shù)目變化與PFS、OS呈負相關(guān)。Wu等[34]觀察453例肺癌患者后發(fā)現(xiàn)化療后CTCs陰性患者疾病控制率（DCR）、PFS、OS均明顯高于CTCs陽性患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。

Muinelo-Romay等[35]報道了在43例晚期NSCLC患者中，分別在基線狀態(tài)、治療第2個周期及第5個周期檢測CTCs，其中在基線狀態(tài)CTCs 5個/7.5 ml的患者與CTCs＜5個/7.5 ml的患者相比具有較低的中位PFS（4.1個月vs 7.6個月，P＜0.05）和中位OS（4.6個月vs 10.7個月，P＜0.01），大部分患者在第2個周期化療時CTCs含量有明顯下降，提示CTCs檢測既可預(yù)測患者療效，也可以判斷治療過程中治療方案是否有效。

李晶等[36]選取中晚期NSCLC患者分別于化療前、2周期化療后檢測CTCs，每2個周期行療效評估，結(jié)果提示CTCs數(shù)目評價與RECIST評價療效比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），顯示兩種評價方法有較高的吻合度。

盡管目前對CTCs檢測無法統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，但大量研究結(jié)果已證明CTCs的存在與腫瘤患者無病生存時間、無進展生存期及總生存期相關(guān)[37]。

4.4 基因檢測NSCLC靶向治療的常見靶點包括表皮生長因子受體（EGFR）、間變淋巴瘤激酶（ALK），近年來針對上述靶點的藥物明顯改善了NSCLC患者的預(yù)后，但耐藥突變的出現(xiàn)嚴重阻礙了靶向治療的進展。對于使用靶向藥物的患者而言，實時監(jiān)測耐藥突變可有效地指導(dǎo)后續(xù)治療，但由于腫瘤標(biāo)本獲取困難，大部分患者不愿選擇二次活檢，而CTCs因其采樣簡便，為實時監(jiān)測治療反應(yīng)提供了可能。但CTCs中的基因突變能否能代表NSCLC原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶尚存在爭議。

Sun等[38]在單細胞層對CTCs的EGFR的18、19、20、21外顯子進行測序，檢測結(jié)果與原發(fā)病灶病理組織檢測結(jié)果相同。Ran等[39]檢測20例組織樣本陽性的肺癌患者CTCs的EGFR基因（19外顯子、L858、T790M）的突變情況，其中95%的患者CTCs陽性,與病理組織檢測（EGFR基因均突變）結(jié)果相近。

Pailler等[40]對18例檢測組織ALK基因重排陽性和14例陰性的NSCLC患者CTCs進行分析，結(jié)果提示陽性組CTCs中均存在多個（4個/1ml）ALK基因重排，而ALK陰性組僅檢測到0或1個CTCs發(fā)生ALK基因重排，因此認為檢測CTCs中的ALK基因重排也可以用于指導(dǎo)ALK抑制劑克唑替尼的治療。

4.5 體外培養(yǎng)CTCs相較于其他液體活檢，優(yōu)勢在于可以進行體外培養(yǎng)，用于藥敏檢測。Zhang等[41]建立NSCLC細胞系，從體內(nèi)體外對其生物學(xué)特征進行研究，但目前在這方面研究較少，有待進一步探索。

綜上所述，CTCs因其費用昂貴、測定標(biāo)準(zhǔn)難以統(tǒng)一、不同檢測方法差異性大等，導(dǎo)致CTCs至今難以廣泛應(yīng)用于臨床，但其異質(zhì)性強、標(biāo)本獲取簡便、無創(chuàng)以及可重復(fù)，將越來越被人們認可，且檢測外周血中CTCs對肺癌早期診斷、臨床分期、療效評價、基因檢測有重要意義，能為延長腫瘤患者生存、提高臨床療效起到促進作用，期待在不久的將來CTCs的檢測為廣大肺癌患者帶來更大的獲益。

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200032上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院腫瘤六科

劉苓霜，E-mail:liuls107@163.com

2017-08-30）

（本文編輯：馬雯娜）