組織蛋白酶S的研究進展

王林燕 王博 戴靈豪 杜仲燕 關旸 丁美紅

組織蛋白酶S的研究進展

王林燕 王博 戴靈豪 杜仲燕 關旸 丁美紅

組織蛋白酶S（Cat S）是半胱氨酸蛋白酶的重要一員，主要分布在淋巴結、脾臟、肺等器官，多在表達主要組織相容性復合物Ⅱ的細胞中表達，在抗原遞呈中發揮重要作用，參與疾病的發生、發展過程。Cat S還與炎癥因子相互作用，參與體內免疫及炎癥反應，在心血管、免疫系統和腫瘤等疾病的發生、發展過程中發揮重要作用。本文通過概述CatS的結構、與疾病的關系、上下游通路、活性檢測方法及抑制劑等方面內容，為今后開展CatS的研究提供部分參考。

組織蛋白酶S 上下游通路 活性檢測 抑制劑

組織蛋白酶（Cat）是在動物組織的細胞內（特別是溶酶體部分）發現的一類蛋白酶，它通過水解肽鏈降解蛋白質以維持細胞內環境穩定。它具有抗原遞呈、細胞信號轉導、激活受體、促進趨化因子或細胞因子釋放等功能。Cat結構最早在20世紀Drenth等在番木瓜中發現，現已發現人體內共有15種Cat，根據水解機制不同可分為絲氨酸、天冬氨酸和半胱氨酸蛋白酶；根據底物特異性，又可分為肽鏈內切酶和肽鏈內外切酶。Cat是由無活性的前體酶原水解而成，先在核糖體結合膜上合成前體酶原，后在高爾基體通過糖基化及磷酸化作用形成甘露糖-6-磷酸蛋白，最后通過溶酶體上甘露糖-6-磷酸特異性受體的識別作用，間接轉運到溶酶體中。Cat S是半胱氨酸蛋白酶家族的一員，具有重要的調節功能，人體Cat S最早由Shi從肺泡巨噬細胞中提取。不同于其他半胱氨酸蛋白酶，Cat S最佳活性pH值為4～6，在中性條件下可保持酶活性；主要分布在淋巴結、脾臟、肺等器官，多在表達主要組織相容性復合物Ⅱ（MHCⅡ）的細胞中表達，在抗原遞呈中發揮重要作用，參與疾病發展過程[1]。此外，Cat S還與炎癥因子相互作用，參與體內免疫及炎癥反應，在心血管、免疫系統和腫瘤等疾病的發生、發展過程中發揮重要作用。本文就CatS的研究進展作一綜述。

1 CatS結構

Cat S具有木瓜蛋白酶家族相似的晶體結構，為單鏈蛋白，含225個氨基酸，相對分子質量為24.8KDa，與其他半胱氨酸蛋白酶結構在氨基酸序列上存在同源性。三維空間結構由2個結構域組成：（1）L結構域，由3個α螺旋和一個疏水口袋組成；（2）R結構域，由含有1個疏水核嵌入的反平行β折疊和位于側面的2個α螺旋組成[2]。2個結構域之間構成狹長裂隙，為催化活性部位。結構中的半胱氨酸25、組氨酸159和天門冬酰胺175構成催化三聯子，是結合底物的重要部位。Cys25中硫陰離子作為親和物質是催化反應的關鍵部位，能夠進攻底物肽。Cat S的N端有3個凹槽（即S1、S2和S3）與底物的特異性結合相關，決定了半胱氨酸蛋白酶抑制劑的特異性。C端存在一個與底物結合的位點，即S1'，在酶與主要組織相容性復合體二類分子保守區的特異性結合中起著重要作用。

2 Cat S與疾病的關系

Cat S可降解細胞內外正常蛋白質，在體內炎癥免疫、抗原遞呈、血管生成、細胞增殖、細胞外基質重塑、損傷、修復等病理、生理過程中發揮著重要的調節功能，與多種臨床疾病的發生、發展和轉歸息息相關。

2.1 自身免疫性疾病 1999年研究表明Cat S與自身免疫性疾病密切相關，Cat S缺陷小鼠對膠原誘導的關節炎易感性較低[3]。Cat S在類風濕關節炎患者的血清和膝關節液中的表達水平明顯升高[11]，巨噬細胞大量表達Cat S并分泌進入軟骨組織，可能會破壞功能性軟骨聚集蛋白聚糖-二型膠原網狀組織的完整性，在炎癥性滑膜細胞中發揮抗原遞呈、基質降解的雙重作用。Cat S抑制劑和F類風濕關節炎ctalkine（趨化因子CX3C亞家族的唯一成員）抗體可減輕類風濕關節炎大鼠的機械性超敏反應和脊髓小膠質細胞反應，可作為治療類風濕關節炎疼痛的潛在藥物[5]。此外，Cat S對系統性紅斑狼瘡也有影響，可驅動MHCⅡ介導的T細胞和B細胞活化并形成生發中心，促使B細胞向漿細胞轉化，從而促進疾病發生、發展，而Cat S抑制劑可通過特異性阻斷自身抗原遞呈而改善疾病[6]。

2.2 慢性氣道炎癥性疾病 相關研究表明，卵蛋白引起的小鼠肺損傷模型與正常小鼠比較，其Cat S基因表達量明顯增加[7]。高氧誘導的肺損傷，經Cat S基因敲除處理，動物肺泡功能明顯改善，并可減少巨噬細胞流入和肺部纖維性病變。采用ELISA檢測健康者與哮喘患者血清中Cat S含量并繪制24h晝夜變化曲線，發現哮喘患者Cat S含量明顯高于健康者，但是24h期間哮喘患者與健康者Cat S含量基本不隨時間變化或變化不明顯[8]。此外，有研究發現Cat S-/-與野生型哮喘大鼠比較，其氣道高反應性、IgE水平均較低，肺部炎癥明顯減弱[9]。亦有關于Cat S啟動子區域的單核苷酸多態性與哮喘發病率的關系研究，發現啟動子上rs7534124和rs1136774單核苷酸多態性可降低漢族人群哮喘易感性[10]。

2.3 心血管疾病 心血管疾病嚴重威脅人類健康，一般與動脈粥樣硬化相關。動脈粥樣硬化的形成原因主要是血管的細胞外基質重塑、彈性蛋白的降解。當血管平滑肌細胞受IL-1β和IFN-γ刺激時，會分泌Cat S并降解不溶性彈性蛋白，從而影響動脈粥樣斑塊穩定性。在血管緊張素Ⅱ的刺激下，心血管部位巨噬細胞的Cat S mRNA表達量增多，巨噬細胞介導的溶膠原和彈性蛋白酶活性明顯增加，通過血管緊張素受體拮抗劑（奧美沙坦）可抑制Cat S的活性，增強Apoe-/-小鼠動脈粥樣斑塊的穩定性[11]。此外，有研究表明Cat S抑制劑RO544－4101可降低慢性腎臟疾病Apoe-/-小鼠動脈粥樣硬化發病率，降低巨噬細胞中生長分化因子-15、單核細胞趨化蛋白-1含量[12]。Cat S還與腹主動脈瘤、靜脈移植排斥反應、急性心肌梗死患者心力衰竭相關。與Apoe-/-Cat S+/+比較，Apoe-/-Cat S-/-小鼠的腹主動脈瘤發病率顯明顯降低[13]。而且人體血液中總Cat S和活性Cat S的含量與BMI、舒張壓和主動脈直徑呈正相關，與最低踝肱指數呈負相關[14]。

2.4 腫瘤 Cat S可誘導肝細胞癌細胞凋亡并增加化學敏感性。血管生成是腫瘤發生的關鍵標志，抑制血管生成是抗腫瘤的新策略。Cat S如同血管內皮生長因子一樣，在血管生成中起著重要作用，在腫瘤微環境中促進細胞外基質的水解與內皮細胞的侵襲，從而誘發血管生成，促使腫瘤的發生、發展。協同使用Cat S抑制劑與抗血管內皮生長因子能起到有效抑制血管生成的作用。Cat S也可介導自噬通量和自噬體、溶酶體的融合，激活自噬激發巨噬細胞M2型極化，誘使腫瘤發生[15]。Cat S與癌癥轉移亦密切相關，它是乳腺-腦轉移的調節劑，依靠水解黏附蛋白并通過血腦屏障遷移。

2.5 其他疾病 Cat S是蛋白酶活化受體2的偏向激動劑，可引起PAR2和瞬時感受器電位離子通道家族香草素受體亞家族依賴性炎癥和疼痛[16]，注射Cat S抑制劑可抗神經性大鼠過敏性疼痛和異常性疼痛。Cat S過表達可使小鼠骨骼肌營養不良，當Cat S基因敲除時，mdx小鼠肌纖維肌膜穩定性明顯增強[17]。在溶酶體運輸和自噬過程中，Cat S與Rab11家庭相互作用使蛋白4表達上調，而下調Cat S可影響巨噬細胞的自噬過程[18]。此外，Cat S還可引起小鼠受體依賴性瘙癢。

3 Cat S上下游通路研究

IFN-γ通過激活Janus激酶/信號轉導子與轉錄激活子通路啟動細胞轉錄功能，上調不同細胞中Cat S的表達量；也可增加小鼠肥大細胞及骨髓源性肥大細胞Cat S的mRNA和蛋白水平，并具有一定的時間劑量依賴關系[19]。miR-31/IRF-1/Cat S通路可能在囊性纖維化肺部疾病的發病中發揮作用，通過miR-31模擬物降低干擾素調節因子1、Cat S的表達和分泌[20]。

Cat S通過激活NF-κB和caspase-3誘導肝細胞癌細胞凋亡并增加其化學敏感性；也可激活CD74，調控趨化因子CCL2的表達，從而對腫瘤微環境產生影響[21]。Cat S可促進表皮生長因子介導的表皮生長因子受體降解，調節表皮生長因子受體信號；而Cat S抑制劑可抑制表皮生長因子受體降解，促使表皮生長因子受體信號延長，促使下游信號轉導和轉錄激活子3、蛋白激酶B信號激活[22]。CatS是Mas相關的G蛋白偶聯受體（Mrgprs）的配體，可激活MrgprC11，從而引起瘙癢。Cat S也是PAR2的偏向激動劑，通過切割PAR2的氨基末端，暴露一個新拴系配體KVDGTS，激活PAR2并產生PAR2的特異性下游信號，刺激第二信使激活，引起PAR2依賴性炎癥和疼痛，使PAR2作為蛋白酶驅動的炎性疼痛放大[23]。

4 Cat S活性檢測

學者們常采用Western blot、ELISA等方法測定酶表達量及含量的變化，但是酶的關鍵參數除含量外，活性也是重要指標。Cat S以前體酶原形式存在時無活性，不發揮生理功能，因此對酶的活性進行精準測定具有重要意義。Cat S活性檢測方法主要有底物檢測、探針檢測。底物檢測通過測定底物濃度或含量的變化反應酶的活性，是經典方法；探針檢測是目前Cat S活性檢測最常用的方法，可分為底物探針檢測和活性探針檢測。

4.1 底物探針檢測 底物探針檢測是將Cat的底物肽與熒光染料鍵和作為Cat的底物，Cat與底物結合并水解肽鏈，釋放出熒光基團，采用特定的熒光檢測方法測定熒光強度，以熒光強度高低反應Cat的活性。目前已有許多底物探針如Z-FR-AMC，Z-Val-Val-Arg-AMC等用于測定Cat S活性。以Z-Phe-Arg-AMC為底物，同時結合分子對接技術研究化合物的Cat S的抑制作用。以Z-VVR-AMC為底物，探究蛋白酶抑制劑對樹突狀細胞中Cat S活性的調節作用。底物探針檢測原理是Cat水解肽鏈，釋放出熒光染料，測定熒光強度，此過程中酶的結合是可逆的，酶的活性依然保存。但底物探針檢測專一性差，易出現假陽性，與Cat S同源性高的其他酶也能水解底物肽，釋放熒光染料；底物肽穿透性差，只可用于檢測細胞裂解液，無法直接檢測組織或細胞內的Cat S活性。但是，不斷有學者對底物探針檢測進行優化探索，使底物檢測的特異性升高，如Steimle等[24]開發的底物Mca-GRWPPMGLPWE-Lys（Dnp）-DArg-NH2在pH7.5時可特異性結合Cat S，提高檢測的特異性、準確性并且節約實驗時間。

4.2 活性探針檢測 活性探針由3個部分組成：可與Cat連接的彈頭部位；增強對1種或多種酶特異性識別的識別元件；可用于檢測的標記物。3個部分元件功能各不相同，相輔相成，共同實現蛋白酶活性的實時體內成像和高通量活性篩選。近年來有學者對Cat S的活性探針研究發現，以放射性元素碘標記的探針可用于體內外檢測Cat S活性[25]。將Cat S底物與棕櫚酸酯化，可實現探針探頭目標定位的長久性和高信噪比；通過小鼠尾靜脈注射，用于體內成像，以實現腫瘤的非侵入性鑒定[26]。將多種原理的探針相結合，如基于近紅外淬火的探針結合綠色熒光反應的探針用于Cat S活性的測定，可實現不同種類探針的互補，為活性蛋白定位[27]。ZPraVG-DMK探針，修飾后的肽基重氮甲基酮可滲透入細胞，測定細胞內Cat S活性[28]。以人cystatin C抑制位點的N-端底物樣區域作為支架，連接到重氮甲基酮作為探針，更易與半胱氨酸蛋白酶B、L、S和K結合，且靈敏度高，可在nM范圍內檢測Cat活性[29]。

活性探針通過共價鍵與Cat不可逆性結合，使Cat失去活性；與底物探針檢測比較，活性探針可穿透細胞，不僅能檢測細胞裂解液，實現活細胞體內定位，同時其檢測特異度和靈敏度均較高。

5 Cat S抑制劑研究

Cat S與多種疾病相關，被認為是類風濕性關節炎、哮喘、腫瘤等疾病的生物治療靶點，因此抑制劑研究是Cat S領域研究的熱點。Cat S抑制劑通過與Cat S的Cys25位點結合，發揮抑制作用，但Cat S同源性較高，對其他Cat可能也會產生抑制作用[30]。因此，研究并開發特異性的Cat S抑制劑是研究的難點。

5.1 化學合成抑制劑 Cat S抑制劑主要有芳氨乙基酰胺類化合物、丁二酸酰胺類化合物、二肽類化合物、非肽類抑制劑等。Battu等[31]基于藥物的三維定量構效關系和分子對接技術研究Cat S的抑制劑，發現新Cat S抑制劑的多個前導分子。Wilkinson等[32]對含氰基Cat S抑制劑進行體內外抗腫瘤藥效學評價，結果表明其具有極大的應用價值和開發潛力。另有研究發現，當化合物不與Cat S的Cys25位點結合，僅與S2和S3位點特異性結合，對Cat S的活性也有抑制作用，同時對其他半胱氨酸Cat活性無影響，如LY3000328化合物，具有Cat S的特異性抑制作用[33]。

5.2 Cat S天然抑制劑 關于Cat S天然抑制劑的研究很少。劉毅夫等[34]研究發現中藥淫羊藿中的淫羊藿苷、淫羊藿素3-O-α-L-鼠李吡喃糖基-7-O-β-D-葡萄吡喃糖醛酸苷、寶藿苷Ⅰ、淫羊藿苷A、箭藿苷B、朝藿定B和大花淫羊藿苷C單體對Cat S的活性有抑制作用。此外，Zhang等[35]研究發現蜂毒素可通過調控VEGF-A/ VEGFR2/MEK1/ERK1/2信號通路抑制Cat S介導的腫瘤生長和血管形成，可能是Cat S的抑制劑。

6 小結

近年來，Cat S因其廣泛的生理功能在國外掀起了研究的熱潮，學者們對Cat S的生物學功能和對疾病的影響開展了深入研究；而關于Cat S影響疾病的機制及其上下游通路的研究尚在探索之中。Cat S對疾病的發生、發展具有重要作用，眾多學者以Cat S作為疾病治療靶點，期望尋找有效的Cat S抑制劑，治療各類疾病。但半胱氨酸蛋白酶的同源性較高，許多抑制劑的特異性低，對其他半胱氨酸蛋白酶亦有抑制作用。因此，尋找一種特異性高、不良反應小的Cat S抑制劑是研究的難點。天然藥物是藥物研發的巨大寶庫，建議充分發揮天然藥物的優勢，在天然藥物中挖掘Cat S抑制劑。Cat S活性檢測是研究Cat S的重要手段，主要有活性探針檢測和底物探針檢測，兩者各有優勢與不足，應根據具體實驗需求選擇合適的檢測方法，建議Cat S活性檢測與Cat S蛋白含量檢測等檢測方法整合，共同闡明科學問題。

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2017-01-23）

（本文編輯：陳丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.6.2017-46

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王林燕，E-mail：linyan0520@126.com