新型綠色防腐劑乳酸鏈球菌素

徐俊進，金陳斌，陳小龍

(1.浙江工業大學 發酵工程研究所，浙江 杭州 310014； 2.浙江新銀象生物工程有限公司，浙江 天臺 317200)

新型綠色防腐劑乳酸鏈球菌素

徐俊進1,2，金陳斌1,2，陳小龍1*

(1.浙江工業大學 發酵工程研究所，浙江 杭州 310014； 2.浙江新銀象生物工程有限公司，浙江 天臺 317200)

乳酸鏈球菌素(Nisin)是一種安全有效的生物防腐劑。綜述其結構、防腐機制、生產工藝、分離純化與檢測等領域的研究進展，并展望其未來發展，以期為相關研究提供參考。

Nisin； 發酵； 生物防腐劑； 防腐機制

乳酸鏈球菌素(Nisin)是某些乳鏈球菌(Streptococcuslactis)和乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)產生的抗菌短肽，能夠有效抑制大多數革蘭陽性細菌和部分革蘭陰性菌，特別是對產孢子的芽孢桿菌、嗜熱芽孢桿菌、致死肉毒芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌等有很好的抑制作用。由于Nisin可由食品級微生物L.lactis發酵產生，因此，純化后的Nisin與發酵液都能被用于食物中，且與其他細菌素相比，Nisin具有很高的抑菌活性，而且添加后不會引起食品任何感官變化，一旦進入人體，即可被人體內的胰凝乳蛋白酶降解，不致在體內殘留，也不會在體內誘導產生致病的抗藥性菌株，更不會與其他抗生素出現交叉抗性。自問世以來，Nisin被廣泛用于乳制品的防腐保鮮等領域。由于具有廣闊的市場效益和經濟價值，Nisin自發現以來備受研究人員關注，是迄今被研究得最為徹底的一種細菌素[1]。

1 Nisin的結構

Nisin有3種天然異構體，Nisin A、Nisin Z和Nisin Q。其中，Nisin A和Nisin Z均由34個氨基酸組成，在結構上只有1個氨基酸不同，即第27位氨基酸殘基，Nisin A為組氨酸殘基，而Nisin Z為天冬酰胺殘基。Nisin Q是新近發現的天然異構體，其結構與Nisin A和Nisin Z分別有3個和4個氨基酸的差異。

Nisin分子常以二聚體或四聚體的形式存在。Nisin分子中含有一些修飾性的氨基酸殘基，包括β-甲基羊毛硫氨酸(β-methyllanthionine)、羊毛硫氨酸(Lanthionine)、脫氫丙氨酸(Dehydroalanine，Dha)和甲基脫氫丙氨酸(Dehy drobutyrine，Dhb)。Nisin A高級結構中含5個有別于其他蛋白質的硫醚鍵，這些硫醚鍵構成了5個環狀結構。Nisin A分子在肽鏈的C端和N端的頂端區還具有一定的可彎曲性[2]。

2 Nisin的防腐機制

2.1 Nisin的抑菌機制

Nisin的抑菌譜很廣，包括乳球菌、葡萄球菌、鏈球菌、微球菌、乳桿菌、片球菌屬、李斯特菌、分枝桿菌等革蘭陽性細菌，特別是對芽孢桿菌和梭狀芽孢桿菌的抑制效果特別明顯。而且，Nisin對這些細菌的孢子比對其營養細胞更敏感[3]。一些研究認為，Nisin可以使細菌細胞膜上形成孔洞，打破質子動力平衡和pH平衡，導致離子泄漏和ATP的水解，從而導致細胞死亡。也有研究表明，Nisin會捆綁Lipid II，而Lipid II是肽聚糖的前體，從而抑制細胞壁的合成[4]。許多革蘭陰性細菌之所以能夠抵抗Nisin的抑制作用，可能就是因為其細胞壁外層的脂多糖(LPS)充當了屏障的作用，從而有效地阻擋了Nisin對細胞膜的傷害。一旦加入EDTA，即可螯合、限制LPS中的Mg2+和Ca2+，達到對LPS的去穩定作用，之后，Nisin就能夠突破屏障，作用于細胞膜上發揮作用[5]。Penna等[6]研究認為，Nisin抑制大腸埃希菌孢子的作用機理是，Nisin與蛋白質上的硫氫基結合，使孢子內含硫氫基的酶失活，且在高溫滅菌的同時搭配使用Nisin，會大幅度提高滅活大腸埃希菌孢子的效率[7]。目前極少數革蘭陽性細菌已經表現出對Nisin的抗性，這是因為其合成了一種叫Nisinase的酶，從而導致Nisin失活[8]。

2.2 影響Nisin防腐性的因素

Nisin的抗菌活性和穩定性受許多化學和物理因素的影響，如pH、鹽濃度和溫度等。其中，pH是一個非常重要的影響因素。Nisin的抗菌活性隨pH升高而下降，溶解度也隨之下降。pH>7時，Nisin幾乎不溶于水。另外，Nisin的穩定性與溶液的pH有關。當溶液的pH值<3時，高溫加熱條件下，Nisin的抗菌活性基本上不發生改變；而當溶液的pH值>4時，加熱條件下，Nisin的抗菌活性會迅速消失。另有研究顯示，當Nisin與其他適合的條件聯合作用時，其抗菌活性能大幅度提高，如適當的冷凍、鹽處理、熱處理和酸味劑等[9]。

Nisin分子含有疏水殘基，因此具有脂水兩親的性質，所以Nisin最好不要用于肉類食品防腐保鮮。因為肉中油脂很多，會溶解Nisin并與之發生作用，從而降低Nisin的抑菌能力。有焦亞硫酸鈉或二氧化鈦存在時，Nisin也會因分解而失活[1]。

3 Nisin的生產方法

3.1 發酵法

通過流動的牛奶或乳清培養L.lactis，再進行固液分離，將液體噴霧干燥，收集干燥后的粉末就可作為商品出售。但該方法制得的Nisin純度低[10](產物包括2.5%的Nisin、72.0%的NaCl、23.8%的牛乳固形物、1.7%的水分)，且Nisin活性濃度僅為1×106IU·g-1(1 g純的Nisin活性單位為40×106IU)。因此，現在很多研究利用膜分離技術與分批發酵相結合，以提高產品中Nisin的濃度，降低成本。

L.lactis在發酵生產Nisin的過程中會產生乳酸，而乳酸的積累會引起發酵液pH下降，進而抑制L.lactis的正常生長。通常采用在發酵培養基中加堿中和或用有機溶劑提取乳酸的辦法來調節pH，但是加入堿之后生成的乳酸鹽對L.lactis的生長也會產生抑制作用。基于以上考慮，華盛頓州立大學的Liu等[11]提出，將產Nisin的L.lactis與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)混合培養來生產Nisin。其原理是，L.lactis在發酵生產Nisin的過程中所產生的乳酸可以被S.cerevisiae利用，而S.cerevisiae在代謝過程中所產生的一些物質又可以被L.lactis作為底物進行利用，2種菌種的相互作用，構成了一個有利于Nisin生產的微生態環境。該研究團隊以乳清作為基礎培養，將相同培養條件下的混菌發酵與常規發酵進行對比。結果顯示，對比常規發酵81.2 mg·L-1的Nisin終濃度，混菌發酵條件下達到了150.3 mg·L-1，增加了85%。另外，利用基因工程技術提高菌種自身的Nisin耐受能力與生產能力也是一種降低成本的重要方法。

3.2 化學法

先合成脫氫丙氨酸與羊毛硫氨酸這2種特殊氨基酸，然后合成硫醚環，再將5個硫醚環片段以縮合反應連接，即可形成完整的Nisin分子，經測試，其抑菌效果與天然的Nisin相同。

4 Nisin的分離純化與檢測

目前，Nisin的分離純化主要采用離子交換膨脹床、親和層析和高效液相層析等方法。但這些方法成本都比較高，而且會引入很多不適于食品添加的化合物。因此，一般還是采用先乙醇抽提，再用硫酸銨沉淀或pH值2.0酸沉淀的方法來分離純化Nisin[12]。

目前，針對細菌素活性的檢測方法有很多，其中最簡單、最常用的方法是瓊脂平板擴散法、牛津杯法和劃線法等。下面著重介紹瓊脂平板擴散法：將滅好菌的效價培養基冷卻至約45 ℃，加入0.5%的Tween-20和2%指示菌菌懸液，搖勻，準確吸取20 mL該培養基加入水平放置的培養皿內，凝固后用直徑8 mm的中空打孔器在平板上打出孔洞，加入含Nisin發酵液(充滿孔洞)或經稀釋的樣液，蓋上皿蓋，靜置0.5 h，移至30 ℃培養箱內培養24 h，測量抑菌圈直徑[13]。

5 研究展望

我國L.lactis菌種資源豐富，但目前在Nisin的研究領域還處于初級階段，生產規模小，發酵水平低，成本高，應用不廣泛。今后，應大力進行Nisin的基礎研究和開發應用，利用生物技術(如基因工程、蛋白質工程、細胞工程等)研發優良工程菌株。通過對Nisin的性質及作用機理的進一步研究，拓展并加速其作為天然生物防腐劑在食品等行業中的應用。

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(責任編輯：高 峻)

2017-03-20

徐俊進(1963—)，男，浙江天臺人，學士，工程師，主要從事生物防腐劑的生產與研究工作，E-mail：973738378@qq.com。

陳小龍(1970—)，男，浙江仙居人，博士，教授，主要從事生物活性物質的生產與研究工作，E-mail：richard_chen@zjut.edu.cn。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170630

TS202.3

B

0528-9017(2017)06-1005-03

文獻著錄格式：徐俊進，金陳斌，陳小龍. 新型綠色防腐劑乳酸鏈球菌素[J].浙江農業科學，2017，58(6)：1005-1007.