嵌合抗原受體修飾T細胞在腫瘤免疫治療中的策略①

魯大鵬 葉園園 王保龍

(安徽醫科大學附屬省立醫院檢驗科，合肥230000)

嵌合抗原受體修飾T細胞在腫瘤免疫治療中的策略①

魯大鵬 葉園園 王保龍

(安徽醫科大學附屬省立醫院檢驗科，合肥230000)

手術、化療和放療是治療腫瘤的傳統方法，但大部分情況下患者都不能獲得理想的療效。近年來，嵌合抗原受體修飾 T 細胞通過基因工程，賦予 T 細胞腫瘤靶向性、更強的殺傷活性和持久的生命力，并取得較好的臨床療效。然而，脫靶效應 、細胞因子風暴等毒性效應卻極大地限制了CAR-T細胞技術的應用。本文就提高CAR-T細胞在治療惡性腫瘤臨床療效方面進行如下綜述。

1 CAR-T細胞的基本結構和發展歷程

嵌合抗原受體(Chimeric antigen receptor,CAR)修飾T細胞是指基因修飾的人工改造體，被重新輸入患者體內后提高效應T細胞識別腫瘤相關抗原(Tumour-associated antigen,TAA)的能力。CARs結構是由胞外抗原結合域(通常來自單鏈抗體可變區基因片段,single chain variable fragment,scFv)、鉸鏈區、跨膜區和胞內區 (包括CD3-ζ鏈或FcεRIγ、共刺激分子信號域受體)構成。

1987 年，Kuwana等[1]首次提出CAR的概念并構建了可特異性識別腫瘤相關抗原的CAR-T細胞原型。第一代CAR信號域是CD3-ζ信號鏈，它能有效地促進T細胞活化和增強T細胞的細胞毒性[2]，但由于腫瘤細胞表面缺乏共刺激分子(第二信號)，CAR-T細胞不能持續性增殖，臨床療效有限。第二代CAR 信號域增加了1個共刺激分子如CD28，當CAR-T細胞識別腫瘤抗原后，胞內信號域和共刺激分子共同活化，促進IL-2合成，使T細胞的增殖、細胞毒性和持續性抗腫瘤能力等方面都有所提高[3]。為了進一步提高CAR-T細胞的免疫學效應，第三代CAR 信號域增加了2個共刺激分子，但實際臨床試驗中其效果是否更好尚未有確切的資料證明。第四代CAR(T cells redirected for universal cytokine killing,TRUCKs)是在第三代CAR的結構基礎上，增加了一個或多個能夠編碼CAR及其啟動子的載體。從而使得轉基因產生的細胞因子能夠結合免疫其他組件，促進機體固有免疫細胞殺傷不能被CAR識別的腫瘤細胞[4]。

2 影響CAR-T細胞免疫療效的因素

2.1靶抗原的選擇 “理想靶抗原”是指：①特異性在腫瘤細胞中表達而不存在正常組織中，主要是由于腫瘤細胞突變所致，是最理想的靶抗原。例如表皮生長因子受體Ⅲ突變型(EGFRvⅢ)是膠質母細胞瘤細胞突變的結果，在正常組織中沒有發現[5]。②過表達于腫瘤組織而低表達于正常組織。腫瘤特異性靶抗原是極少的，因此我們需要根據靶抗原在正常組織和腫瘤組織中的不同表達水平和密度，平衡靶抗原和CAR-T細胞療法毒性效應的利弊，選出最理想的 TAA，作為CAR-T細胞免疫治療中的主要靶抗原。比如CD19是B細胞成熟過程的表面抗原，在大多數的B細胞惡性腫瘤表面都能表達，常用于淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病等[6,7]。

2.2效應T細胞的選擇 效應T細胞是CAR表達生物學活性的主要加工廠，對CAR的抗腫瘤效應和持續時間至關重要，體外擴增前，對潛在的最理想的 T 細胞亞群進行精確檢測和分離可提高CAR-T細胞免疫療法的效果。在體外，效應記憶 T 細胞(Effector memory T cell,TEM)的細胞毒活性和增殖能力要優于中樞記憶 T 細胞 (Central memory T cell,TCM)，但在體內TCM不僅具有形成免疫記憶的潛能，還有更持久的抗腫瘤活性[8]。干細胞樣記憶 T 細胞(Stem cell memory T cell,TSCM)具有持久的自我更新特性，因此TSCM具有高增殖和持續性存在的潛能。高表達CD62L、CD95和CCR-7的CD45RA+T細胞亞群中TSCM比TCM具有更有效的抗腫瘤活性和更久的存在時間[9]。

2.3共刺激分子的選擇 CAR胞內信號區的共刺激分子在調節T細胞擴增、存在時間以及抗腫瘤效應等方面發揮著重要的作用，但不同的共刺激分子的生物學活性有所差別。常見的共刺激分子有CD28、腫瘤壞死因子超家族成員9 (4-1BB)、腫瘤壞死因子超家族成員4(OX40)、可誘導共刺激分子(ICOS)和CD27，其中CD28和4-1BB都能有效地促進IL-2和IFN-γ的分泌。研究表明4-1BB共刺激分子比CD28共刺激分子更適合CAR胞內信號區的構建[10]，因為4-1BB能有效地促進記憶T細胞的擴增和減少持續性CAR-T信號的耗盡，并且4-1BB信號似乎是CD8+記憶T細胞持續性存在的必需信號，而CD28促進初始T細胞擴增。一些研究卻顯示CD28和4-1BB的擴增和抗腫瘤效應沒有明顯的區別[11]。Hombach等[12]證明了CD28-CART細胞比CD28-OX40-CART細胞更有效，因為CD28-OX40共刺激分子可促進活化誘導細胞死亡(Activation-induced cell death,AICD)和減少抗腫瘤功能。某些研究卻顯示含有兩個共刺激分子(如CD28和4-1BB)的CAR-T細胞比僅有單一共刺激分子的CAR-T細胞更有效地改善T細胞的存在時間和細胞毒性[11]。以上研究表明共刺激分子極大地影響CAR-T細胞療法的效果，但最理想共刺激分子的種類和數量仍未確定，還需在體外和體內進一步的研究。

2.4腫瘤微環境的改變 腫瘤微環境的改變是實體瘤CAR-T細胞免疫治療中最難克服的障礙，改變的腫瘤微環境通過多種調控機制抑制效應T細胞的浸潤、激活和抗腫瘤功能，即使相當數量級的效應 T 細胞到達病灶，也無法發揮有效的殺傷作用。腫瘤微環境中的“免疫調節抑制劑”如程序性細胞死亡蛋白1(PD-1)，通過與腫瘤細胞或基質細胞表面的PD-L1和PD-L2配體相互作用而降低效應T細胞的抗腫瘤活性[13]。調節性 T 細胞(Tregs) 和骨髓抑制細胞(MDSCs)在腫瘤微環境中起抑制作用，并且腫瘤細胞分泌的CCL22和CCL2細胞因子可分別誘導CCR4+Tregs 細胞[14]和CCR2+MDSCs[15]細胞聚集在腫瘤部位，最終使機體處于免疫耐受狀態而降低效應T細胞的抗腫瘤作用。同時，腫瘤細胞分泌的轉化生長因子-β(TGF-β)和IL-10也具有免疫抑制作用[16,17]，TGF-β可通過抑制CD8+效應T細胞和促進CD4+輔助T細胞轉變為 Tregs細胞發揮免疫抑制作用。

3 增強CAR-T細胞免疫療效的策略

3.1宿主淋巴細胞預清除 預處理中宿主淋巴細胞清除是CAR-T細胞治療中必須進行的過程，直接影響最終的臨床療效，其作用機制為：①通過化療(藥物主要包括環磷酰胺、噴司他丁和苯達莫司汀)和/或靶向單克隆抗體(如利妥昔單抗)減少免疫抑制性T細胞數量(如Tregs細胞)，從而為體外輸入的CAR-T細胞提供合適的體內微環境。②通過減少淋巴細胞對活化因子的影響，增加活化因子(如IL-7、IL-15)的累積，從而促進CAR-T細胞的增殖[18]。

3.2自殺基因 自殺基因是一種人工調控的“安全開關”，可特異性識別刪除體內多余的CAR-T細胞。自殺基因是通過藥物誘導激活而清除CAR-T細胞，如單純皰疹病毒胸苷激酶 (Herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-TK)基因、誘導凋亡相關基因caspase-9(iCaspase-9)和EGFRΔ基因。HSV-TK 的免疫原性較高，iCaspase-9和EGFRΔ基因是人源性蛋白，免疫原性低。自殺基因系統在臨床試驗中已成功去除CAR-T細胞，其中治療效果最好的是他克莫司結合蛋白-12(FK506 binding protein-12,FKBP-12)與iCaspase-9結合形成的融合蛋白，這種融合蛋白被小分子二聚AP1903激活后，可導致T細胞的快速凋亡和清除[19]，同時FKBP-12 是一種誘導效率高 、特異性強的安全開關，故與iCaspase-9的結合治療受到廣泛使用。然而，自殺基因系統需要一段時間才能被激活，所以這些安全開關一般用于慢性毒性反應的治療。

3.3階梯式劑量方案 目前CAR-T細胞有效起始劑量的確定尚沒有明確的指導方針，研究者多采用階梯式劑量方案，它是指CAR-T細胞起始劑量由少至多，且不斷監測患者的毒性效應，當可能出現嚴重毒性效應時立即停止。第二代和三代CAR-T細胞起始劑量應比第一代少，且給予淋巴細胞預清除的患者的CAR-T細胞起始劑量也比未經任何預處理的患者少。Morgan[20]小組和Ahmed[21]小組都用了HER2-CART進行過繼性免疫治療，最終Ahmed研究小組獲得了更好的臨床療效和輕微的毒性效應，其中一個重要的原因是他們采取了階梯式劑量方案，起始劑量 (1×104)CAR-T細胞/m2，逐級升高至(1 × 108)CAR-T細胞/m2，但Morgan小組直接單一高劑量(7.9 × 109) CAR-T細胞/m2。

3.4雙特異性CAR-T細胞的治療 雙特異性CAR可分為三類：①簡單雙特異性CAR，指兩種特異性的CAR共同修飾T細胞。例如，只有當效應T細胞同時表達針對前列腺癌的兩種特異性靶抗原，前列腺特異性膜抗原(Prostate specific membrane antigen,PSMA)和蛋白錯誤折疊循環擴增(Protein misfolding cyclic amplification,PMCA)時，簡單雙特異性CAR-T細胞才能進行殺傷作用，正常細胞因不會同時存在PSMA和PMCA兩種靶抗原而不被效應T細胞攻擊[22]。②異質性CAR(inhibitory CAR，iCAR)，是基于調節正常T細胞信號的抑制性分子如 CTLA-4、PD-1、BTLA-4、LAG-3或各種各樣的磷酸酶的CAR。iCAR 通常存在于正常細胞，低表達或者不存于腫瘤細胞，所以iCAR能選擇性抑制正常細胞的細胞因子分泌、增殖和毒性擴散，iCAR和另一種特異性CAR共同修飾的效應T細胞只會引起腫瘤細胞的殺傷作用，而沉默保護正常細胞[23,24]。③串聯性CAR(Tandem CAR,TanCAR)，是一種能同時識別細胞表面兩種靶抗原的特異性CAR，因腫瘤細胞表面含有兩種相關靶抗原，正常細胞不含有或者只含有一種相關靶抗原，進而TanCAR-T細胞只殺傷腫瘤細胞[25]。

3.5提高CAR-T細胞免疫療效的持續性 自身免疫系統對CAR-T細胞外源肽的識別和破壞直接縮短了CAR-T細胞的存在時間，效應T細胞沒有充足的時間殺傷腫瘤細胞而降低了抗腫瘤療效。提高CAR-T細胞免疫療效的持續性方案主要有兩種：①通過耗盡機體內B細胞防止宿主對外源肽的免疫作用，進而保護CAR-T細胞。②多重受體與細胞因子受體，它們是Wilkie等[26]設計修飾T細胞的兩種人造受體，一種受體可識別TAA，另一種受體為T細胞提供促進生長的細胞因子信號。如由T1E28z受體和細胞因子受體4αβ 共同修飾的CAR-T細胞作用時，T1E28z 可識別TAA，而細胞因子受體4αβ中的β 鏈亞單位與內源性IL-4 、IL-2 和 IL-15 共同結合，IL-4可誘導IL-2 和 IL-15炎性刺激信號，進而促進CAR-T細胞持續性作用[27]。

4 提高 CAR-T細胞免疫療效的未來方向

4.1改善腫瘤免疫微環境 改善腫瘤免疫微環境可以極大地提高CAR-T細胞免疫療效和降低預后的不良反應，但由于腫瘤微環境的復雜性和調控機制的多樣性，單一療法并不能取得有價值的臨床療效，基于腫瘤免疫微環境的主要調控機制，可以結合以下幾點綜合治療：①阻斷免疫抑制劑途徑，大量數據證明加入PD-1免疫抑制途徑的阻斷劑(抗PD-1)后，CAR-T細胞療效因PD-1與 PD-L1/PD-L2的相互作用被抑制而得到極大的提高[28]。②對于免疫抑制細胞，以Tregs細胞為例，CAR-T細胞結合特異性的共刺激分子(如CD28)可以降低Tregs細胞對腫瘤微環境的抑制作用[29]。另外，化療和放療可以通過誘導Tregs 細胞凋亡或特異性的去除Tregs而改善免疫抑制，一項研究中發現以低劑量的環磷酰胺為基礎的化療可有效清除 Tregs 細胞，達到免疫調節作用，聯合使用其他免疫療法可改善預后[30]。③細胞因子，TGF-β和IL-10是主要的免疫抑制因子，通過RNAi 技術等基因工程方法，下調 T 細胞表面 TGF-β 和IL-10受體表達,進而提高CAR-T細胞療效。此外，IL-2、IL-12和IL-15 等活化因子可以促進效應T細胞的免疫作用，創造利于 T 細胞存活并發揮效能的微環境，通過誘導CAR-T 細胞分泌活化因子進而產生更有效的抗腫瘤作用[31-33]。

4.2CAR-T細胞外泌體的治療 CAR-T細胞分泌的外泌體是一種直徑為30～150 nm的膜性囊泡，外泌體中含有核酸、蛋白和脂類，是細胞間信息交流的重要載體[34]。CAR-T細胞外泌體治療是CAR-T細胞免疫治療的進一步發展，不僅具有CAR-T細胞高效的抗腫瘤效應，還能避免脫靶效應和細胞因子風暴等毒性效應。實體瘤由于腫瘤微環境的改變，降低了CAR-T細胞的活性而不能準確定位到腫瘤部位。外泌體是納米級大小、且分布廣泛，可通過各種生物性屏障如血腦屏障[35]。一旦分泌,它可擴散至鄰近細胞或通過血液和其他體液準確定位到腫瘤部位。并且，外泌體包含的不同信息如microRNAs、mRNAs 和蛋白質，在細胞間傳遞時可以同時向多個細胞和多個部位傳遞信息[36]，使得外泌體作為“直接攻擊物質”時可以迅速通過囊泡內容物識別靶細胞表面特異性受體廣泛殺傷腫瘤細胞。此外，除了CAR-T細胞自身分泌的物質,還可以加入其他物質至CAR-T細胞外泌體中,避免腫瘤細胞產生耐藥性。結合或交替使用 CAR-T細胞療法和CAR-T細胞外泌體療法也許會增強抗腫瘤效應。

4.3局部CAR-T細胞治療 CAR-T細胞不能精確歸巢到腫瘤部位(尤其是實體瘤)是影響其抗腫瘤療效的一個主要原因，而在一些惡性腫瘤中，局部性疾病是影響癌癥患者發生率和死亡率的主要原因，為此直接進行局部治療比系統性治療能取得更有效的結果。早期Adusumilli等[37]模仿人類胸膜惡性腫瘤構建一個原位模型，利用M28zCAR 修飾以間皮素為靶抗原的T細胞，并評估效應T細胞在兩種途徑中的療效。他們發現，CAR-T細胞經胸膜腔內注射的療效要遠遠超過經體液循環途徑注射的療效，并且只需后者 1/30的M28z T細胞劑量就能誘導長期的完全緩解。此外，胸腹腔內注射的CAR-T細胞可擴散至循環系統和胸腔外區域的特性使其也能用于轉移性腫瘤的治療，例如上皮卵巢癌和惡性胸膜間皮瘤，由于傾向于局部腹膜和胸膜腔內擴散應給予局部CAR-T細胞治療[37]。

4.4CAR-NK細胞治療 自然殺傷細胞(Natural killer cell,NK) 是具有抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調節功能的細胞，CAR-NK細胞免疫治療也越來越多的用于臨床試驗。與CAR-T細胞治療相比，它有三個優勢：①CAR-NK細胞的半衰期較短，并且體外擴增的人源性NK細胞分泌的細胞因子譜包括γ干擾素、IL-3和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)等，不同于CAR-T細胞分泌的TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12和IFN-α等炎癥細胞因子，因此CAR-NK細胞輸入不會引起細胞因子風暴。②CAR-NK細胞不會引起移植物抗宿主反應(GVHD)[38]。③CAR-NK細胞具有較強的殺傷腫瘤細胞功能，不僅可以通過抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用 (ADCC)途徑，也可以經各種非特異性途徑殺傷腫瘤細胞。以CD19、CD20、CD244和 HER2為靶抗原的 CAR-NK92細胞在臨床前試驗中已表現出極強的抗腫瘤效果[39]。但CAR-NK細胞仍存在脫靶效應、轉染率低等問題，我們尚需優化CAR-NK結構、轉染方法等以制備最佳的免疫細胞。

5 結語

CAR-T細胞免疫治療是一種發展前景廣泛的抗腫瘤方法，在臨床應用中已獲得一定的療效，但由于腫瘤細胞的異質性和腫瘤免疫微環境的改變，CAR-T細胞療法在大多數腫瘤的治療中并不能取得理想的結果，尤其是實體瘤。因此在新一代的CAR-T細胞設計中，我們必須優化設計方案、構建最佳的CAR-T 細胞 、降低毒性效應，提高CAR-T細胞治療的安全性和有效性。同時CAR-T細胞外泌體治療、局部CAR-T細胞治療等方法將會是未來CAR-T細胞治療體系中極其重要的部分。相信通過大家的不懈努力，CAR-T細胞療法將會克服各種障礙，成為繼三大常規腫瘤治療方法的新主流，為腫瘤患者帶來新的希望。

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[收稿2016-11-17 修回2017-01-17]

(編輯 倪 鵬)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.034

①本文受安徽省科技攻關項目(1604a0802072)資助。

魯大鵬(1990年-)，男，在讀碩士，主要從事CAR-T細胞與肺癌的相關性研究，E-mail：742654086@qq.com。

及指導教師：王保龍(1965年-)，男，博士，主任檢驗師，主要從事肺癌方面的研究，E-mail：wbl196555@163.com。

R730.51

A

1000-484X(2017)09-1430-05