血清抗幽門螺旋桿菌抗體和抗AQP4抗體在中樞神經系統脫髓鞘病中的相關性研究①

熊英瓊 梅竹君 章 偉 屈新輝 吳曉牧

(南昌大學研究生院，南昌330006)

血清抗幽門螺旋桿菌抗體和抗AQP4抗體在中樞神經系統脫髓鞘病中的相關性研究①

熊英瓊 梅竹君②章 偉 屈新輝②吳曉牧②

(南昌大學研究生院，南昌330006)

目的：探討血清抗幽門螺旋桿菌抗體(HP-IgG)和抗AQP4抗體在多發性硬化(MS)、視神經脊髓炎(NMO)中的相關性。方法：對33例MS患者、7例NMO患者和35例健康體檢者采用間接酶聯免疫吸附法(ELISA法)檢測血清中抗HP的IgG抗體，采用細胞間接免疫熒光法(CBA)檢測血清標本抗AQP4抗體；分析MS、NMO患者中HP-IgG及抗AQP4抗體的陽性率，并對比抗AQP4抗體陽性與抗AQP4抗體陰性患者間HP-IgG陽性率的差別。結果：MS組、NMO組和正常對照組血清中抗血清HP-IgG抗體陽性率分別為69.70%、85.71%、42.86%，差別有統計學意義(P<0.05)，其中MS組、NMO組與正常對照組血清中抗HP-IgG抗體陽性率差別均有統計學意義(P<0.05)；但MS組與NMO組血清中抗HP-IgG抗體陽性率差別無統計學意義(P>0.05)。MS組、NMO組和正常對照組血清中抗AQP4抗體陽性率分別為4.2%、85.71%、0%，差別有統計學意義(P<0.05)。MS組和NMO患者組中抗AQP4抗體陽性患者與抗AQP4抗體陰性患者抗HP-IgG抗體陽性率分別為72.73%、79.31%，差別無統計學意義(P>0.05)。結論：HP感染是引起MS及NMO疾病發生的危險因素，而與MS及NMO患者是否含有抗AQP4抗體無關。

多發性硬化；視神經脊髓炎；抗幽門螺旋桿菌抗體；抗AQP4抗體

多發性硬化(Multipe sclerosis,MS)和視神經脊髓炎(Neuromyelitis optica,NMO)均為自身免疫介導的中樞神經系統的脫髓鞘疾病，這兩種疾病確切的病因以及發病機制尚不清楚，但多發性硬化及視神經脊髓炎臨床進程的異質性表明，這兩種脫髓鞘疾病的發病機制包含復雜的遺傳和環境因素[1,2]，其中環境因素包括感染因素(病毒及細菌等)和非感染因素。近年來，幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori，HP)感染被證明與自身免疫性疾病有關，如其可導致自身免疫性胃炎等[3]，其亦被懷疑與MS及NMO有關[4]。本研究通過檢測MS、NMO患者和正常對照者血清中抗血清幽門螺旋桿菌抗體陽性率，探討幽門螺旋桿菌感染在MS及NMO發生和進展中的作用。

1 資料與方法

1.1臨床資料 收集江西省人民醫院神經內科2012年4月至 2015 年5月住院的MS、NMO患者(表1)，并收集同期我院體檢中心的健康體檢者血清作對照。MS符合2005年修訂的McDonald診斷標準，NMO符合2006年Wingerchuk等提出的NMO新校正標準。MS患者33例，NMO患者7例，健康體檢者35例。各組在年齡、性別構成上差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1血清標本采集 在患者及健康體檢者知情同意下，清晨空腹狀態下，經患者手背淺表靜脈采集外周靜脈血3～4 ml,置促凝管中，2 000 r/min，離心10 min，取血清，置于EP管中，標號，置于-80℃冰箱凍存備用。

1.2.2血清幽門螺旋桿菌IgG(HP-IgG)抗體檢測 采用純化抗原預包被板ELISA原理，以酶標記SPA作為標記物。加入底物TMB顯色后，反應終止，于450 nm波長測各孔OD值，OD值的大小與待檢抗HP-IgG抗體含量成正比。取96/48孔酶標板，設置陽性對照孔、陰性對照孔、各血清孔、空白孔。加樣前先將陽性對照液、陰性對照液、血清充分混勻。 加樣： 每孔各加入相應血清100 μl, 空白孔不加，將反應板充分混勻，置37℃震蕩培養器，反應30 min。洗板：用稀釋洗滌液充分洗滌5次，濾紙印干。每孔加入酶標抗體工作液100 μl，將反應板充分混勻后，置37℃震蕩培養器，反應30 min。洗板：用稀釋洗滌液充分洗滌5次，印干。每孔加入底物工作液100 μl，混勻后置37℃震蕩培養器，暗處反應 30 min。每孔加入100 μl終止液，充分混勻。提前5 min預熱Multiskan Ascent酶標儀，30 min內將ELISA反應板置Multiskan Ascent酶標儀，在450nm處測吸光值。所有OD值均減除空白值后再計算。判定結果：P/N=標本OD值/陰性對照OD值。P/N≥2.1為陽性；1.5≤P/N<2.1為可疑標本。P/N<1.5為陰性。陰性對照小于0.10時以0.10計。陰性對照OD值正常范圍應<0.21，陽性對照≥0.40以上實驗結果成立。

表1患者組病例資料

Tab.1Clinicalcharacteristicsofsubjects

GroupsMaleFemaleAgeCourseofdiseaseEDSSMSpatients141945.59±14.1412.58±18.993.90±1.88NMOpatients1643.14±17.2112.86±12.212.31±1.57Healthycontrol152044.57±15.26

1.2.3血清抗AQP4抗體檢測 將pEGFP-N1-M23-AQP4質粒通過磷酸鈣轉染試劑轉染接種于6孔細胞培養板的HEK293細胞，在熒光顯微鏡下觀察并選擇瞬時轉染率高的細胞培養孔，用含G418的篩選培養液篩選并挑單克隆細胞進行培養擴增，獲得綠色熒光穩定表達的單克隆細胞，并以此細胞為底物，采用CBA法檢測M23-AQP4表達及分布，以鑒定獲得綠色熒光穩定表達的單克隆細胞是否為M23-AQP4穩定表達細胞。EK293-M23-AQP4接種并固定于96孔細胞培養板，PBS浸洗2 min×5次，正常山羊血清工作液(50 μl/孔)室溫封閉1 h，去除封閉液，血清標本(1∶50稀釋，50 μl/孔，每個標本設3個孔)4℃孵育過夜，PBS浸洗2 min×5次，Cy3標記的羊抗人二抗(1∶500稀釋，50 μl/孔)室溫孵育1 h，PBS浸洗2 min×5次，50%(體積分數)甘油-0.5 mol/L pH9.0～9.5碳酸鹽緩沖液封閉，熒光顯微鏡下觀察，藍光激發下的綠色熒光區域，經綠光激發后觀察到紅色熒光為陽性，無紅色熒光為陰性。將檢測結果為陽性的血清標本用倍比稀釋法稀釋為1∶50～1∶1 638 400檢測抗AQP4抗體，以不能觀察到紅色熒光的最小稀釋比例的前一比例作為該標本的抗AQP4抗體滴度。

1.3統計學處理 采用SPSS17.0軟件進行數據分析。各組間抗體陽性率比較，采用χ2檢驗或校正χ2檢驗公式計算。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1三組間幽門螺旋桿菌IgG抗體比較 MS組、NMO組分別與健康對照組抗HP IgG抗體陽性率比較，差別均有統計學意義；MS組與 NMO組抗 HP IgG抗體陽性率比較，差別無統計學意義，見表2。

表2各組間血清抗幽門螺旋桿菌IgG抗體陽性率檢測

Tab.2ComparisonofpositivedetectingrateofHP-IgGineachgroup

GroupsnHp-IgGpositiveHp-IgGnegativePositiverateMSpatients33231069.7%1)NMOpatients76185.7%1)Healthycontrol35152042.86%

Note：Vs control group，1)P<0.05.

圖1 AQP4抗體檢測(CBA法，熒光顯微鏡，標尺50 μm)Fig.1 AQP4 antibody detected(CBA,fluorescemce mic-roscope,scaleplate 50 μm)

2.2三組間抗AQP4抗體比較 以HEK293-M23-AQP4細胞為底物的CBA法檢測顯示，與熒光顯微鏡下經綠光激發可觀察到紅色熒光的是抗AQP4抗體陽性血清標本(圖1C2)，且紅色熒光與綠色熒光重疊(圖1C3)，不能觀察到紅色熒光的是抗AQP4抗體陰性血清標本(圖1D2)，以HEK293-pEGFP-N1細胞為底物也不能觀察到紅色熒光(圖1E2)。

MS組、NMO組分別與健康對照組抗AQP4抗體陽性率比較，差別均有統計學意義；MS組與 NMO組抗AQP4抗體陽性率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

2.3抗AQP4抗體陰、陽性患者間抗HP-IgG抗體陽性率比較 MS組與NMO組中抗AQP4抗體陽性者與陰性者抗HPIg-G抗體陽性率比較，差別無統計學意義。見表4。

表3各組間血清抗AQP4抗體陽性率檢測

Tab.3CompartisonofpositivedetectedrateofAQP4ineachgroup

GroupsnAQP4antibodypositiveAQP4antibodynegativePositiverateMSpatients3352815%1)2)NMOpatients76185.7%1)Healthycontrol35000

Note：Vs control，1)P<0.05；vs NMO group 2)P<0.05.

表4抗AQP4抗體陰、陽性患者間抗HPIg-G抗體陽性率

Tab.4ComparisonofpositivedetectingrateofHP-IgGbetweenAQP4positivegroupandnegativegroup

GroupsnPositiveNegativePositiverateAQP4positive118372.73%AQP4negative2923679.31%

Note：Comparison of two groups，P>0.05.

3 討論

雖然MS、NMO的病因和發病機理還不清楚，但大量研究顯示，MS及NMO最有可能是由多基因遺傳和復雜的環境因素(包括感染因素和非感染因素)相互作用引起的。根據分子模擬學說，MS患者感染的病原體，可能與中樞神經系統髓鞘蛋白(MBP)或少突膠質細胞存在共同抗原，病原體感染后，激活體內T細胞，活化的T細胞通過血-腦屏障(Blood-brain barrier,BBB)，與抗原呈遞細胞(Antigen presenting cell,APC)呈遞的MBP等靶抗原結合后，觸發自身免疫反應，導致中樞神經系統白質脫髓鞘病變，臨床上出現各種神經功能缺失癥狀[5]。幽門螺旋桿菌感染作為MS及NMO進程中自身免疫反應潛在的觸發因素，越來越受到人們的重視。

HP為革蘭染色陰性，呈彎曲狀、螺旋形或S形,微需氧。HP感染較為常見，為慢性、持續性感染，其感染范圍廣，呈世界性分布，在發展中國家尤甚。雖然幽門螺旋桿菌HP僅定植于胃黏膜，但是其與宿主間相互作用，通過誘導大量的炎性介質及細胞因子的釋放，導致慢性自身免疫反應，引起自身免疫性疾病，如特發性血小板減少性紫癜等[6]。研究認為，幽門螺旋桿菌中性粒細胞激活蛋白(HP-NAP)與引起吉蘭-巴雷綜合征(Guillain-Barre syndrome,GBS)的空腸彎曲菌蛋白顯著同源，提示HP感染有可能參與脫髓鞘疾病(如GBS、 MS及NMO等)的發生與進展[7]。還有研究發現，在MS及MNO進程中，一系列涉及HP感染的相關因素參與BBB的破壞，包括炎癥介質(HP-1感染誘導產生的細胞因子，趨化因子)和氧化應激，且HP介導的血腦屏障損傷或許可允許抗AQP4抗體及T淋巴細胞進入中樞神經系統，因此，其在NMO的病理機制中發揮了重要作用；此外，HP-NAP可激活中性粒細胞、單核細胞和肥大細胞，從而參與血腦屏障的破壞[8]。近年來，有學者報道HP感染在MS中的致病因素，即通過促進各種趨化因子/炎癥介質的釋放，包括主要的中性粒細胞趨化因子IL-8和中性粒細胞激活蛋白(Neutrophil activator protein,NAP)的參與，抗水通道蛋白4(Aquaporin4,AQP4)抗體相關的神經損害，如MS患者感染HP后，體內可產生抗幽門螺旋桿菌中性粒細胞激活蛋白抗體(即抗HP-NAP抗體)和/或抗AQP4抗體，因HP可能和神經組織之間存在交叉模仿，故可引起神經損傷，導致脫髓鞘反應[9]。新近在希臘的一個中心觀察到MS的一種特殊類型，即臨床孤立綜合癥(Clini-cally isolated syndrome，CIS)與HP感染有強烈相關性，在為期兩年的研究中觀察到，與CIS對照者比較，成功根除HP的CIS患者，其第二次發作的可能性大幅下降，且平均EDSS評分下降，即HP-1在希臘的CIS患者中更為常見，且對HP感染的CIS患者而言，根除HP能延緩CIS的進展[10]。綜上，目前研究認為，HP感染參與MS與NMO疾病的發生和進展。

本研究通過各組間血清抗HP抗體陽性率的比較，MS與NMO組抗體陽性率均高于健康組，進一步證實HP感染參與了MS與NMO疾病的發生和進展。此外，抗AQP4抗體陽性率在兩組疾病中統計學有差異，與目前對NMO疾病的診斷標準相符，抗AQP4抗體陽性支持NMOSD的診斷。

目前對于HP感染在參與MS及NMO疾病的發生與進展的過程中，是否與患者含有抗AQP4抗體有關仍有爭議。2009年通過研究亞洲人兩個不同的MS，即經典型MS(CMS)和視神經脊髓炎型MS(OSMS)，結果顯示抗AQP4抗體陽性MS，其HP感染率顯著高于抗AQP4抗體陰性的MS(即CMS組)；同時還觀察到與健康對照組比較，抗AQP4抗體陽性的MS患者和抗AQP4抗體陰性的OSMS患者的HP-NAP抗體更常見，并且HP-NAP抗體水平與Kurtzke′s擴展殘疾狀態量表評分(EDSS)呈正相關,即提示抗HP-NAP可能與MS患者中抗AQP4抗體相關的神經損傷有關[11]。也有研究認為，HP只對抗AQP4抗體陽性的NMO/NMOSD是危險因素，而對抗AQP4抗體陰性的NMO/NMOSD則不是危險因素[12]。

本研究發現抗AQP4抗體陽性者與陰性者抗HP-IgG抗體陽性率差別無統計學意義，HP感染參與了MS及NMO疾病的發生與進展，但與患者是否含有抗AQP4抗體無關。HP-NAP與抗AQP4抗體并不都是捆綁存在于HP上，而HP-NAP與AQP4間的分子交叉模擬可能并不是一個可靠的潛在的機制。但本研究的NOM組患者樣本例數較少，導致抗AQP4抗體陽性樣本不足，對兩種抗體的相關性研究有必要繼續擴大樣本量，分不同疾病組進行分析。

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[收稿2017-04-24]

(編輯 許四平 劉格格)

Astudyofcorrelationofanti-Helicobacterpyloriantibodyandanti-aquaporin4antibodyincentreneurologicalsystemdemyelinationdisease

XIONGYing-Qiong,MEIZhu-Jun,ZHANGWei,QUXin-Hui,WUXiao-Mu.

GraduateSchoolofNanchangUniversity，Nanchang330006,China

Objective:To investigate the relationship between anti-Helicobacter pylori antibody(Hp-IgG)and anti-aquaporin 4 antibody which are in neuromyelitis optica(NMO)and multiple sclerosis(MS).Methods: Serum specimens were collected from the 33 patients with MS,7 patients with NMO,and 35 health examination cases.Hp-IgG were detected by enzyme-linked immunosorbent assasy and anti-aquaporin 4 antibody were detected by cell based assay respectively. The positive rate of Hp-IgG and anti-aquaporin 4 antibody were analyzed,and the difference of Hp-IgG positive rate was compared between patients with Hp-IgG positive and negative.Results: Serum Hp-IgG positive rate of MS,NMO and normal control groups were 69.70%,85.71% and 42.86% respectively with a significant statistically difference of Hp-IgG(P<0.05).Positive rate of serum anti HP-IgG antibody in MS group,NMO group and normal control were significantly different(P<0.05);but there was no statistical significant difference of anti HP-IgG antibody positive rate between MS group and NMO group(P>0.05).Serum anti AQP4 antibody positive rate of MS,NMO and normal control groups were 4.2%,85.71% and 0% respectively with a significant statistically difference of anti AQP4 antibody(P<0.05). The positive rates of anti HP-IgG which were in MS patients and NMO patients with positive anti AQP4 antibody were 72.73%,the positive rates of anti HP-IgG which were in MS patients and NMO patients with negative anti AQP4 antibody were 79.31%,the difference was not statistically significant(P>0.05).Conclusion: HP infection is a risk factor for the occurrence of MS and NMO,but not associated with MS and NMO patients with anti AQP4 antibodies.

MS;NMO;Anti-Helicobacter pylori antibodym;Anti-aquaporin 4 antibody

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.020

①本文為江西省科技廳科研院所基礎設施配套項目(20123BBA13050)和國家臨床重點專科建設項目(衛辦醫政函[2012]649號)。

熊英瓊(1976年-)，女，碩士，主任醫師，主要從事神經免疫及神經重癥方面的研究，同時供職于南昌大學研究生學院，E-mail：xyq21cn@139.com。

及指導教師：屈新輝(1970年-)，男，碩士，主任醫師，主要從事神經免疫及神經變性病方面的研究，E-mail：quxinhui@163.com。

R741

A

1000-484X(2017)09-1371-04

②江西省人民醫院神經內科,南昌330006。