母-胎免疫調節機制在妊娠高血壓綜合征病理過程中的作用

李麗娜 徐振宇 孔麗娜

(皖南醫學院弋磯山醫院婦產科，蕪湖241001)

母-胎免疫調節機制在妊娠高血壓綜合征病理過程中的作用

李麗娜 徐振宇①孔麗娜

(皖南醫學院弋磯山醫院婦產科，蕪湖241001)

目的：分析妊娠高血壓綜合征(PIH)患者外周血中免疫細胞因子水平變化及滋養層細胞中免疫相關轉錄因子的基因、蛋白表達情況，探討母-胎免疫調節機制在妊娠高血壓綜合征病理過程中的作用。方法：納入PIH患者50例作為觀察組，選擇同期分娩的正常妊娠婦女40例作為對照組。ELISA法檢測兩組孕婦外周血中IFN-γ、IL-4、IL-17及TGF-β水平；實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法和蛋白質印跡法(Western blot)分別測定兩組孕婦胎盤滋養層細胞中轉錄因子T-bet、GATA-3、RORC、Foxp3的mRNA及蛋白表達情況。結果：①觀察組外周血中IFN-γ和IL-17水平明顯高于對照組，TGF-β水平明顯低于對照組(P<0.05)；兩組間IL-4水平無明顯差異(P>0.05)；觀察組IFN-γ/IL-4、IL-17/TGF-β比值均明顯大于對照組(P<0.05)。②與對照組比，觀察組T-bet、RORC的mRNA及蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)，而GATA-3、Foxp3的mRNA及蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)，T-bet/GATA-3及RORC/Foxp3比值均顯著增大(P<0.05)。結論：PIH具有明顯的Th1/Th2及Th17/Treg比例失衡現象，其病理機制可能與Th細胞介導的母-胎免疫耐受機制功能紊亂有關。

妊娠高血壓綜合征；母-胎免疫耐受；滋養層細胞；細胞因子；轉錄因子

妊娠高血壓綜合征(Pregnancy-induced hypertension,PIH)簡稱妊高征，是目前產科常見的并發癥之一，也是妊娠期特有的疾病，包括妊娠期高血壓、子癇前期、子癇、慢性高血壓并發子癇前期以及慢性高血壓合并妊娠[1]。PIH在健康產婦中的發生率為6%，在有妊高征病史的孕婦中甚至高達18%，嚴重危及母嬰健康[2]。因此，明確PIH發病機制并及早防治對保障孕產婦及胎兒生命安全具有重要意義。但目前關于PIH的具體發病機制尚未完全明確，現有研究資料表明，PIH的發病與免疫因素有關，因母-胎免疫調節功能紊亂造成的妊娠失敗仍是目前難以克服的問題[3]。本研究通過分析PIH患者的免疫細胞因子及其轉錄因子的表達情況，探討其相關的母胎免疫調節機制在PIH病理過程中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象 選擇2015年1～12月于本院婦產科就診的PIH患者50例，作為對照組，年齡23～35歲，平均(29.8±3.9)歲；妊娠28～40周；其中PIH輕度16例、中度23例、重度11例。PIH的診斷及嚴重程度分級標準參照2013年人民衛生出版社出版的《婦產科學(第8版)》中推薦的標準[1]。排除妊娠前有心臟病、高血壓、腎病、糖尿病及抗磷脂綜合征等病史的患者。選擇同期在本院就診的正常健康妊娠婦女40例作為對照組，年齡24～37歲；平均(29.5±4.0)歲；妊娠28～40周。兩組均為初產婦，年齡、孕周差異無統計學意義，具有可比性(P>0.05)。

1.1.2主要儀器和試劑 主要儀器：低溫高速離心機(美國Thermo Fisher公司)；多功能酶標儀(美國BioTeke公司)，NanoDrop 2000C超微量分光光度計(美國Thermo Fisher公司)，7500型實時熒光定量PCR系統(美國ABI公司)，全自動凝膠成像分析系統(美國Thermo Fisher公司)。

主要試劑：肝素鈉(150 U/mg)、IFN-γ、IL-4、IL-17及TGF-β ELISA檢測試劑盒(美國Invitrogen公司)；胎牛血清、細胞培養液、DMEM(美國Gibco公司);青霉素-鏈霉素混合溶液(100×雙抗)、無菌PBS、胰蛋白酶(美國HyClone公司)；Percoll細胞分離液、HEPES(北京索萊寶科技有限公司)；DNaseⅠ膠原酶和抗體(美國Sigma公司)；總RNA提取試劑盒、DEPC、逆轉錄試劑盒、蛋白提取試劑盒(美國Thermo Fisher公司)；2×SYBR Green RT-qPCR 試劑盒(美國BioTeke公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術公司)；T-bet、GATA-3、RORC、Foxp3引物(上海生工生物有限公司合成)。其余常規試劑均為國產分析純。

1.2方法

1.2.1外周血細胞因子水平檢測 兩組孕婦均于入院后、產前采集外周靜脈血，肝素抗凝后3 000 r/min 離心15 min，分離出血漿，ELISA法檢測血漿中IFN-γ、IL-4、IL-17及TGF-β的水平。

1.2.2胎盤滋養層細胞獲取 ①分別取兩組中行剖宮產的孕婦術后的無菌胎盤組織，無菌條件下剪取蛻膜層與羊膜層之間的絨毛組織，以無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗凈后剪碎，用0.25%的胰蛋白酶+DNaseⅠ型膠原酶消化30 min后離心、棄去上清并收集細胞，加入細胞培養基DMEM重懸，重復消化2次，共收集細胞3次。②將收集到的單細胞懸液用Percoll分離液進行分離、純化，以含20%胎牛血清、1%雙抗和25 mmol/L HEPES的高糖DMEM培養液重懸細胞沉淀并置于37℃，5% CO2培養箱中培養。

1.2.3滋養層細胞總RNA提取及檢測 收集培養48 h后的滋養層細胞，Trizol法提取細胞中總RNA；RNA定量后參照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄操作；采用RT-qPCR法檢測T-bet、GATA-3、RORC、Foxp3 mRNA表達；反應程序：95℃2 min(變性)，95℃15 s(循環反應)，60℃15 s(40個循環)，4℃保存。

1.2.4滋養層細胞總蛋白提取及檢測 收集培養48 h后的滋養層細胞，提取細胞總蛋白，100℃金屬浴5 min使蛋白變性；BCA法測定總蛋白濃度；Western blot法檢測T-bet、GATA-3、RORC、Foxp3蛋白表達。

2 結果

2.1兩組外周血中免疫細胞因子水平分析 與對照組比較，觀察組孕婦外周血中IFN-γ和IL-17水平均明顯較高(P<0.05)，而TGF-β水平明顯較低(P<0.05)，IL-4水平有所降低但兩組間差異無統計學意義(P>0.05)；觀察組的IFN-γ/IL-4和IL-17/TGF-β比值均明顯大于對照組(P<0.05)。見表1。

2.2兩組滋養層細胞中T-bet、GATA-3、RORC、Foxp3mRNA表達水平分析 與對照組比，觀察組孕婦滋養層細胞中的T-bet、RORC mRNA表達水平均明顯較高(P<0.05)，而GATA-3、Foxp3 mRNA表達水平均明顯較低(P<0.05)，但T-bet/GATA-3及RORC/Foxp3比值顯著增大(P<0.05)。見表2。

2.3兩組滋養層細胞中T-bet、GATA-3、RORC、Foxp3蛋白表達水平分析 與對照組比，觀察組孕婦滋養層細胞中的T-bet、RORC蛋白表達水平均明顯較高(P<0.05)，而GATA-3、Foxp3蛋白表達水平均明顯較低(P<0.05)，T-bet/GATA-3及RORC/Foxp3比值顯著增大(P<0.05)。見圖1。

GroupsIFN-γ(ng/L)IL-4(ng/L)IL-17(ng/L)TGF-β(ng/L)IFN-γ/IL-4IL-17/TGF-βObservationgroup21.25±3.865.84±1.1518.62±2.685.22±0.843.92±1.163.46±0.72Controlgroup15.49±1.576.06±1.2810.55±1.439.64±1.572.71±0.651.14±0.18t8.615-1.65216.602-17.3895.88619.860P<0.0010.102<0.001<0.001<0.001<0.001

GroupsT-betGATA-3RORCFoxp3T-bet/GATA-3RORC/Foxp3Observationgroup5.24±1.331.01±0.203.26±0.811.14±0.395.52±1.832.95±1.23Controlgroup2.35±0.681.55±0.411.84±0.502.88±0.771.85±0.590.70±0.33t12.221-8.5688.591-15.06712.19611.242P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

圖1 兩組滋養層細胞中T-bet、GATA-3、RORC、Foxp3蛋白表達Fig.1 T-bet,GATA-3,RORC and Foxp3 protein levels of placenta cytotrophoblast in two groupsNote:Compared with the control group,*.P<0.05.

3 討論

母胎界面主要由來自母體的蛻膜基質細胞、蛻膜免疫細胞和來自胚胎的滋養細胞構成，是建立和維持妊娠的核心結構[4]。正常妊娠可看作是一種成功的同種異體移植，攜帶父系抗原的胚胎不僅不被母體免疫系統排斥，還能與母體建立獨特的母-胎界面免疫耐受微環境，以維持成功妊娠，母-胎免疫耐受失調可導致子癇前期、自然流產等不良妊娠結局[5,6]。

母-胎免疫耐受機制中，Th細胞介導的適應性免疫應答至關重要。在不同細胞因子的刺激下，由初始CD4+T細胞分化的Th0細胞進一步分化為Th1、Th2、Th17及Treg細胞，并發揮不同的生物學作用[7]。Th1細胞主要分泌IFN-γ、TNF-α等細胞因子，具有細胞毒性作用，能夠抑制滋養層細胞入侵并誘導其凋亡，并通過增強蛻膜巨噬細胞的活力來抑制胚胎植入，不利于妊娠的維持；Th2細胞與Th1相反，其分泌的細胞因子IL-4可刺激滋養層細胞生長和入侵，提高子宮容受性，對妊娠具有免疫營養和保護作用[8]。Th17細胞主要介導炎癥性疾病及自身免疫性疾病，其分泌的細胞因子IL-17可促進絨毛外滋養細胞的侵襲并抑制其凋亡[9]。Treg細胞則通過分泌抑制性細胞因子如TGF-β，促進CD4+CD25-T向CD4+CD25+Treg分化，形成母-胎界面的Treg優勢，間接發揮免疫調節作用[10]。因此，正常生理妊娠時主要呈現輔助型T細胞2(Th2)型免疫優勢和調節性T細胞(Treg)擴增現象，Th1/Th2和Th17/Treg平衡是維持正常妊娠的必備條件[4]。而另一方面，Th1/Th2和Th17/Treg平衡對母-胎免疫耐受具有維持作用[11,12]。故推測母-胎免疫耐受可能參與妊娠高血壓綜合征(PIH)等病理妊娠過程，但其具體調節機制尚未完全清晰。

本研究通過對比分析PIH患者與正常妊娠婦女外周血中免疫細胞因子水平結果發現，與正常妊娠婦女相比，PIH患者外周血中IFN-γ和IL-17水平均明顯升高，TGF-β水平明顯降低，IL-4降低幅度不明顯，但IFN-γ/IL-4和IL-17/TGF-β比值均明顯增大，提示PIH患者存在Th1/Th2和Th17/Treg比例失衡，呈現Th2型及Treg免疫弱勢。當Th1/Th2失衡時，滋養細胞發生浸潤和增生障礙，導致胎盤發育不良，即可出現PIH等妊娠疾病。

為了進一步探討PIH的發病機制，本研究從生物分子層面繼續探討母-胎免疫耐受機制在PIH病理過程中的作用。轉錄因子對細胞的分化具有重要的調控作用。轉錄因子T-bet、GATA-3、RORC及Foxp3分別是Th1、Th2、Th17及Treg細胞相應的特異轉錄因子，能夠調控各類型Th細胞特征性細胞因子的表達[13]。T-bet/GATA-3和RORC/Foxp3比值的測定較其細胞因子水平測定更能客觀反映Th1/Th2和Th17/Treg細胞的分化[14]。本研究RT-qPCR結果顯示，PIH患者的T-bet及RORC的mRNA和蛋白表達水平均較對照組明顯升高，而GATA-3及Foxp3的mRNA和蛋白表達水平均較對照組明顯降低，因此PIH患者的T-bet/GATA-3和RORC/Foxp3比值顯著增大，呈明顯的Th2型及Treg免疫弱勢，與血細胞因子水平表達變化趨勢相一致。

綜上所述，妊娠婦女若存在明顯的Th1/Th2和Th17/Treg比例失衡則導致母-胎免疫耐受形成障礙，母體免疫排斥同種異體胎兒，引發PIH。因此PIH的發病可能與Th細胞介導的母-胎免疫耐受機制功能紊亂密切相關。

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[收稿2016-12-22 修回2017-01-15]

(編輯 張曉舟)

Effectoffetal-maternalimmunetoleranceonpregnancy-inducedhypertension

LILi-Na,XUZhen-Yu,KONGLi-Na.

DepartmentofObstetricsandGynecology,WannanMedicalCollegeYijishanHospital,Wuhu241001,China

Objective:To analyze the levels of immune cytokine in peripheral blood(PB) and the expressions of immune related transcription factors in placenta cytotrophoblast,which in patients with pregnancy-induced hypertension(PIH).And to explore the effect of fetal-maternal immune tolerance on pregnancy-induced hypertension.Methods:50 cases patients with PIH were selected as the observation group,and 40 healthy people were chosen as the control group.Enzyme-linked immunoassay(ELISA) was performed to detect the levels of IFN-γ,IL-4,IL-17 and TGF-β in peripheral blood.Quantitative Real-time PCR(RT-qPCR) and Western blot were used to analyze the mRNA expressions and protein levels of T-bet,GATA-3,RORC and Foxp3 in placenta cytotrophoblast,respectively.Results:①Compared with the control group,the IFN-γ and IL-17 levels in peripheral blood in the observation group were obviously higher and the TGF-β level was greatly lower(P<0.05).There was no significant difference of IL-4 level between the two groups(P>0.05),but the ratios of IFN-γ/ IL-4 and IL-17/TGF-β in the observation group were larger than that in the control group(P<0.05).②Compared with the control group,the mRNA expressios and protein levels of T-bet and RORC in the observation group were increased significantly(P<0.05),but that of GATA-3 and Foxp3 were decreased greatly(P<0.05).Thus,the ratios of T-bet/GATA-3 and RORC/Foxp3 in the observation group were significantly larger than that in the control group(P<0.05).Conclusion:PIH is occurred with the imbalance of Th1/Th2 and Th17/Treg,and it might be associated with the mechanism of fetal-maternal immune tolerance disorder that induced by Th cells.

Pregnancy-induced hypertension;Fetal-maternal immune tolerance;Placenta cytotrophoblast;Cytokines;Transcription factors

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.025

李麗娜(1976年-)，女，博士，副教授，副主任醫師，主要從事產科疾病及分子生物學方面的研究，E-mail：lilina765@163.com。

R714.2

A

1000-484X(2017)09-1398-04

①皖南醫學院弋磯山醫院藥劑科，蕪湖241001。