苦味類中藥成份藉苦味受體途徑對氣道炎癥過程的遏制效應①

劉美花 周向東 李 琪 劉 峰 王 杰 鐘有清

(海南醫學院第一附屬醫院呼吸內科，海口570102)

·中醫中藥與免疫·

苦味類中藥成份藉苦味受體途徑對氣道炎癥過程的遏制效應①

劉美花 周向東 李 琪 劉 峰 王 杰 鐘有清

(海南醫學院第一附屬醫院呼吸內科，海口570102)

目的：探討苦味受體(Bitter taste receptor，TAS2Rs)在苦味類中藥組份治療慢性氣道炎癥中的抗炎效應。方法：實驗分為三組(n=8)，即空白對照組、PM2.5組(霧化吸入PM2.5懸液復制大鼠慢性氣道炎癥模型)和PM2.5+檸檬苦素組(陳皮提取物干預)，分別以ELISA、RT-PCR和Westem blot檢測各組大鼠支氣管/肺組織炎癥因子及TAS2Rs mRNA和蛋白表達水平。結果：PM2.5刺激組炎癥因子TNF-α和IL-13的mRNA和蛋白表達水平較對照組明顯增高，TAS2R14的mRNA和蛋白表達變化不明顯；檸檬苦素干預組炎癥因子TNF-α和IL-13的mRNA和蛋白表達水平較PM2.5組降低，TAS2R14的mRNA和蛋白表達水平則明顯增高。結論：苦味類中藥組份吸入治療可遏制慢性炎性氣道的炎癥因子產生及釋放，并刺激肺部TAS2Rs的表達增加，故認為苦味類中藥組份激活氣道TAS2Rs可能是其發揮抗炎效應的重要機制。

苦味受體;苦味中藥;炎癥因子;氣道炎癥

氣道的慢性炎性過程是慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary desease,COPD)形成及發展的重要表征，多種炎癥細胞和細胞因子參與該過程[1,2]，目前的抗炎治療藥物雖能有效地減少炎癥因子的分泌，但由于存在副作用多及缺乏器官特異性等問題而不夠理想。苦味受體(Bitter taste receptors,TAS2Rs )是與人體感受苦味物質密切相關的一類G蛋白偶聯受體，近幾年研究發現人體呼吸系統也表達部分苦味受體[3]。目前國內外對肺部TAS2Rs的支氣管舒張作用研究較多，而對其抗炎效應涉及甚少，鑒于臨床上多數具抗炎作用的中藥組份具有突出的苦味，故認為苦味受體的激活可能在氣道慢性炎癥的形成過程中起著拮抗作用，但其確切機制尚不得知。本研究采用臨床上常用的苦味類中藥陳皮的苦味成分檸檬苦素為刺激因素，研究TAS2Rs的激活對慢性氣道炎癥的作用，以期為TAS2Rs在慢性氣道炎癥的治療作用提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料、試劑 TH-150C型大容量大氣總顆粒物智能采樣器(Andersen公司，美國)；石英纖維膜(Whatman公司，美國)；Wistar大鼠，SPF級，雌雄不限，4～6周齡，體質量(200±20)g[廣東省醫學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK(粵)2013-0002]；中藥單體化合物：檸檬苦素(質量分數99.5%)，購自西安開來生物工程有限公司；TNF-α、IL-13 ELISA試劑盒(名勁生物科技有限公司，上海)；兔抗鼠β肌球蛋白(β-Actin)多克隆抗體(碧云天生物技術有限公司，上海)；HRP標記的羊抗兔多克隆IgG抗體(SantaCruz，美國)；RNA抽提試劑盒，MMLV(重組鼠白血病病毒反轉錄酶)第一鏈cDNA合成試劑盒，實時熒光定量PCR試劑盒(貨號：DRR820A，TaKaRa公司，日本)；RIPA裂解液(由碧云天生物技術有限公司提供，上海)；兔抗鼠TAS2R14多克隆抗體(Abcam公司，英國)；兔抗鼠TNF-α、IL-13、GAPDH一抗(均Calbiochem公司)；所有引物合成均由上海生物工程有限公司完成。

1.2方法

1.2.1PM2.5 的采集及懸浮液的制作 到建筑工地附近，用TH-150C型大容量大氣總顆粒物智能采樣器采集大氣中的PM2.5顆粒物，將顆粒物采集在20 cm×20 cm的玻璃纖維濾膜上，連續采樣24 h，采集連續1個月，剪短吸附PM2.5的纖維濾紙，對折后侵入超純水，以超聲低溫震蕩30 min，用紗布過濾洗脫液后，濾液于4℃、10 000 r/min下20 min離心3次，棄上清液，稱其質量后保存于-20℃冰箱，用生理鹽水配成40 μg/ml顆粒物懸液，超生震蕩15 min后混合均勻，保存于4℃冰箱備用。

1.2.2實驗動物分組、染毒 大鼠觀察喂養3 d無異常情況后隨機分為三組(n=8)分組實驗條件如下：①空白對照組：以生理鹽水(6 ml)霧化吸入。②PM2.5組：以PM2.5的顆粒物懸液(40 μg/ml)6 ml經超聲霧化吸入進行毒染，約30 min/次，1次/d，染毒溫度37℃，染毒時間持續4周，制成慢性氣道炎癥的動物模型。③PM2.5+檸檬苦素組：在給予PM2.5毒染1 h后給予霧化吸入20 μmol/L的檸檬苦素溶液(6 ml)，約30 min/次，1次/d。第28天處死大鼠，均在最后一次染毒實驗處理結束24 h后處死，剪開大鼠頸部皮膚，暴露氣管，分別收集肺泡灌洗液，剝離氣管和肺臟，將肺臟和氣管收集于-80℃凍存備用。

1.2.3ELISA法檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)中TNF-α、IL-13的含量 各組大鼠經腹腔麻醉后，頸部切開插入氣管導管，用4℃無鈣鎂Hanks液10 ml分2次灌洗，使回收的BALF不少于5 ml，經1 000 r/min離心10 min，取BALF上清液備用。標準品的稀釋和加樣：按試劑盒說明書進行。加樣：各實驗分組設 有3個復孔，另設置1個空白孔，分別吸取BALF上清液0.1 ml包被酶標板，4℃過夜，封閉采用含1%牛血清白蛋白的PBS(0.01%mol/L)-Tween 20(0.05%)于室溫下封閉1 h，一抗以1∶500倍稀釋，取抗大鼠氣道TNF-α、IL-13單抗RTEll 100 ml，37℃孵育1 h，辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG以1∶1 000稀釋，取100 μl，37℃孵育1 h，底物溶液100 μl，于37℃顯色15 min后停止反應。最后于492 nm處測光密度值作為TNF-α、IL-13含量的相對值(OD值)。

1.2.4RT-PCR法檢測支氣管肺組織中TAS2R14和TNF-α、IL-13 mRNA含量 采用Trizol法分別抽提各組動物肺組織總的RNA，經核酸檢測儀測定RNA的濃度和在260 nm和280 nm的吸光度(A)值，樣品A260/A280比值均介于1.8～2.0，樣品的總RNA做初步定量后，保存于-20℃備用。隨后采用兩步法進行RT-PCR。參照試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。引物序列見表1。滅菌PCR管中依次加入Mgcl2：(25 mmol/L) 4.0 μl、10×PCR反應緩沖液5.0 μl、上、下游引物各1.0 μl、dNTP 4.0 μl、cDNA 2.0 μl、Taq酶(5×106U/L) 0.5 μl，定容至50.0 μl，輕輕混勻離心后進行PCR擴增。先于94℃ 預變性3 min，后緊跟34個循環，循環參數：94℃ 45 s，54℃ 30 s，70℃ 60 s，后72℃延伸5 min補齊末端。PCR產物均經1.5%瓊脂糖電泳鑒定，結果經光密度面積積分分析，均以與管家基因GAPDH mRNA的比值作為目的基因mRNA的相對值。

表1RT-PCR各目的基因引物序列

Tab.1PrimersequencoftargetgenesforRT-PCR

TargetgeneForwardReverseTAS2R145'-TGCTGCTTCTTGTGACTTCGGTCT-3'5'-GTGTGCTGCATCTTCTTGCGATGT-3'TNF-α5'-TTTGATCCCTGACATCTGGA3'5'-GGCCTAAGGTCCACTTGTGT-3'IL-135'-ACTTGCTTGCCTTGGTGGTC-3'5'-TAGGGGAGTCTGGTCTTGTG-3'GAPDH5'-CATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3'5'-AGTGATGGCATGGACTGTGGTCAT-3'

1.2.5Western blot法檢測TAS2R14和TNF-α、IL-13的蛋白含量 各組大鼠肺和氣管組織分別稱取0.1 g，加入1 ml含20 μl，100 μg/ml的PMSF和10 μl 磷酸酶抑制劑RIPA裂解液勻漿10 min，后置冰上裂解10 min，4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清液，采用Brad-ford法對上清液進行蛋白定量并分裝后，于-20℃保存備用。分別取各組蛋白樣品，經過含有12%丙烯酰胺的SDS-PAGE及含5%丙烯酰胺的SDS-PAGE分離-濃縮膠電泳分離，印跡轉移至PVDF膜，用5%脫脂牛乳(PBS稀釋)于搖床上封閉1 h后，加入兔抗鼠TAS2R14(1∶500)多克隆抗體，TNF-α、IL-13和β-actin單克隆抗體稀釋比均為(1∶1 000)，置于4℃冰箱孵育過夜，第二天取出于搖床上孵育1 h，洗膜3次后加入HRP標記的山羊抗兔IgG (1∶2 000)，室溫孵育1 h。經徹底洗滌后ECL顯色，加反應液與入底物，暗室曝光5 min。結果經密度面積積分分析，均以與內參β-actin的產物條帶的比值作為相對含量。

2 結果

2.1ELISA檢測BALF中TNF-α、IL-13蛋白表達情況 PM2.5吸入刺激后， TNF-α、IL-13蛋白表達水平顯著高于對照組；而與PM2.5刺激組比較，PM2.5+檸檬苦素組的TNF-α、IL-13蛋白表達水平下降。該結果表明，PM2.5可誘導氣道炎癥因子的產生增加，而檸檬苦素對PM2.5誘導的氣道炎癥因子的產生有抑制作用。見表2。

GroupsTNF-αIL-13Controlgroup0.39±0.020.23±0.03PM2.5group0.78±0.041)0.51±0.081)PM2.5+limoningroup0.63±0.062)0.38±0.032)

Note：1)P<0.01 compared with the control group;2)P<0.05 compared with PM2.5 group.

2.2Real-time PCR檢測支氣管/肺組織TAS2R14和TNF-α、IL-13 mRNA的轉錄情況 PM2.5刺激后，TNF-α、IL-13 mRNA表達水平較對照組明顯升高；而與PM2.5組相比，PM2.5 +檸檬苦素組的TNF-α、IL-13 mRNA表達水平則顯著下降，同時TAS2R14 mRNA表達水平明顯升高。該結果提示，檸檬苦素可激活肺部TAS2R14的mRNA 表達，從而遏制PM2.5引起的炎癥因子的轉錄。見表3，圖1。

2.3Western blot檢測支氣管/肺組織中TAS2R14和TNF-α、IL-13蛋白表達情況 PM2.5吸入刺激后，氣道的TNF-α、IL-13蛋白表達量較對照組明顯升高；而與PM2.5組相比，檸檬苦素干預組的TNF-α、IL-13蛋白表達水平則顯著下降，同時TAS2R14 mRNA表達水平明顯升高。該結果表明，檸檬苦素可激活肺部TAS2R14的蛋白表達，其激活可進一步抑制PM2.5誘導的炎癥因子的表達。見表4，圖2。

GroupsTNF-αIL-13TAS2R14Controlgroup0.27±0.060.27±0.090.25±0.09PM2.5group0.75±0.101)0.72±0.111)0.27±0.07PM2.5+limoningroup0.31±0.012)0.35±0.042)0.53±0.072)

Note：1)P<0.01 compared with the control group;2)P<0.05 compared with PM2.5 group.

圖1 各組炎癥細胞因子和苦味受體的mRNA表達水平Fig.1 mRNA expression levels of inflammatory cytokines and bitter taste receptorNote: 1.Control group；2.PM2.5 group；3.PM2.5+ limonin group.

GroupsTNF-αIL-13TAS2R14Controlgroup0.29±0.070.29±0.120.27±0.01PM2.5group0.64±0.051)0.63±0.041)0.30±0.03PM2.5+limoningroup0.32±0.012)0.34±0.052)0.52±0.062)

Note：1)P<0.05 compared with the control group;2)P<0.05 compared with PM2.5 group.

圖2 各組炎癥細胞因子和苦味受體的蛋白水平Fig.2 Protein levels of inflammatory cytokines and bitter taste receptor in each groupNote: 1.Control group；2.PM2.5 group；3.PM2.5+ limonin group.

3 討論

炎癥細胞的浸潤是慢性氣道炎癥性疾病的主要病理特征之一，各類炎癥細胞侵潤所釋放的大量炎癥因子和炎癥介質是疾病發生發展的始發環節，亦是引起黏液高分泌并導致氣道阻塞的重要事件[4]。COPD急性加重期的患者常伴有如TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-13等炎癥因子的大量釋放，從而導致氣道炎癥加重，氣道水腫加重，氣道阻塞，甚者出現缺氧和二氧化碳潴留[5,6]。中醫中藥輔助抗炎治療已獲肯定，臨床上常用的抗炎清熱、止咳化痰類中藥如陳皮、桔梗、遠志、前胡、款冬花等多數帶有苦味成分，“苦”物質可以抗炎，這是廣泛認可的，但“苦”為何能抗炎卻眾說紛紜，無確切的解釋。

TAS2Rs是一類表達于味覺感受細胞的G蛋白偶聯受體，味覺細胞的TAS2Rs被苦味物質激活后，可與G蛋白發生偶聯，通過G蛋白的經典信號通路轉導，使味覺細胞發生去極化并釋放神經遞質，將信號傳給大腦，從而感知苦味[7,8]。自國外研究證實TAS2Rs在氣道表達之后，相繼的研究結果顯示氣道上皮TAS2Rs的激活可產生舒張支氣管及促進纖毛擺動作用[9,10]，而其對氣道炎癥的作用涉及甚少。已有研究通過篩選發現，陳皮的藥效成分檸檬苦素和白果藥效物質蘆丁、奎寧對TAS2Rs的亞型TAS2R14受體具有顯著的激動作用[11]。據此認為“苦”物質可能借激活氣道上的TAS2Rs發揮其抗炎效應。

本研究采用PM2.5為誘導因素，制成大鼠的慢性氣道炎癥模型，以具代表性的苦味中藥陳皮的苦味單體“檸檬苦素”為干預刺激因素，并選取在呼吸道及肺組織高表達的TAS2R14為靶目標進行研究。結果顯示：PM2.5刺激后，炎癥因子TNF-α及IL-13的mRNA和蛋白表達水平升高，說明PM2.5可誘導炎癥因子的產生進而形成慢性氣道炎癥。以檸檬苦素對PM2.5誘導的氣道炎癥進行干預后，炎癥因子TNF-α及IL-13的mRNA和蛋白表達水平明顯下降，表明苦味單體檸檬苦素對炎癥因子的產生具有遏制作用。此外，對各組的TAS2R14檢測結果表明，檸檬苦素干預組TAS2R14的基因轉錄及翻譯表達較未干預組明顯升高，提示中藥苦味組份刺激可引起支氣管/肺組織的TAS2R14的激活表達，說明TAS2R14參與了苦味質的抗炎效應過程。

本實驗選擇TNF-α和IL-13作為炎癥反應強度的觀察指標，是因為TNF-α是由單核巨噬細胞及內皮細胞產生的一種代表性炎性細胞因子，對炎癥、感染及免疫源性反應產生首發性應答效應[12]，具有多種前炎性介質的功能，是重要的細胞因子啟動子，能啟動其他炎性介質如IL-1β等釋放及促進中性粒細胞脫顆粒，對炎癥過程起瀑布性放大作用[13,14]。而另一指標IL-13作為白細胞介素家族的代表，其主要由活化的Th細胞分泌，可激活B細胞的增殖和IgE的產生，屬多效能細胞因子。IL-13是至今為止所知的重要炎性因子之一，其可導致呼吸道炎癥、黏液分泌增加和杯狀細胞增生等多種呼吸道病理改變[15]。由于炎癥因子與COPD患者的病情進展和預后密切相關，故本實驗著重觀察苦味素受體的激活與炎癥反應強度的關系，結果提示肺部TAS2Rs的激活不僅可減少TNF-α介導相關炎性細胞因子的釋放及阻遏白細胞的聚集，亦可削弱炎性因子誘導的杯狀細胞增生及促黏液高分泌形成等作用，還能進一步抑制由中性粒細胞脫顆粒產生對細胞外蛋白的分解效應，從而阻遏炎癥應答、血管生成和組織纖維化的發生。

目前研究已證實苦味質可激活氣道上皮的TAS2Rs產生舒張支氣管及促進纖毛擺動作用，而本實驗則進一步證實了TAS2Rs的活化還具有抗炎效應，表明TAS2Rs對呼吸道具有多種有益效應。這不僅為臨床上苦味類中藥發揮抗炎效應提供了客觀的解釋依據，亦為其他“苦”味類藥物的治療提供了新的詮釋機制及藥物干預靶點。

[1] 江德鵬,尤列·皮爾曼,維克多·科羅索夫,等.白細胞介素-13通過FOXA2調控氣道上皮細胞黏液分泌[J].中國免疫學雜志,2011,27(2):99-102.

[2] 童 瑾,尤列·皮爾曼,維克多·科羅索夫,等.甘草酸對白介素13誘導的大鼠黏液高分泌的作用[J].中華醫學雜志, 2013,93(28):2225-2228.

[3] Deshpande DA,Wang WC,Mcllmoyle EL,etal.Bitter taste receptors on airway smooth muscle bronchodilate by localized calcium signaling and reverse obstruction [J].Nat Mel,2010,16(11):1299-1304.

[4] 崔利萍,田 明,吳麗娟,等.炎癥因子TSLP、TNF-α和IL-8對不同氣道炎癥性疾病的影響及臨床意義[J].中國臨床研究,2014,27(7):776-777，781.

[5] Ji MF,Su XB,Su XH,etal.Identification of novel compounds for human bitter taste receptors [J].Chem Biol Drug Des,2014,84(1):63-74.

[6] Fehr J,Meyer D,Widmayer P,etal.Expression of the G-protein alpha-subunit gustducin in Mammalians permatozo [J].Com Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol,2007,193(1):21-34.

[7] Doggrell SA.Bitter taste receptors as a target for bronchodilation [J].Expert Opin Ther Targets,2011,15(7):899-902.

[8] Shah AS,Ben-Shahar Y,Moninger TO,etal.Motile cilia of human airway epithelium are chemosensory[J].Science,2009,325(5944):1131-1134.

[9] Finger TE,Bottger B,Hansen A,etal.Solitary chemo receptor cells in the nasal cavity serve as sentinels of respiration [J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(15):8981-8986.

[10] Shah AS,Ben-Shahar Y,Moninger TO,etal.Motile cilia of human airway epithelia are Chemosensory [J].Science,2009,325(5944):1131-1134.

[11] 胡毅翔,蔡 偉,張歡歡,等.基于肺部苦味受體抗哮喘天然活性成分篩選模型的建立與應用[J].中草藥,2016,47(5):775-780.

[12] Braun C,Hamacher J,Morel DR,etal.Dichotomal role of TNF in experimental pulmonary edema reabsorption[J].Immunol,2005,175(5):3402-3408.

[13] Mukhopadhyay S,Hoidal JR,Mukherjee TK.Role of TNF-alpha in pulmonary pathophy-siology[J].Respir Res,2006,7:125.

[14] Li Q,Zhou XD,Kolosov VP,etal.Nicotine reduces TNF-α expression through a α7nAChR/MyD88/NF-κB Pathway in HBE16 airway epithelial cells[J].Cell Physiol Biochem,2011,27:605-612.

[15] Yu HM,Li Q,Zhou XD,etal.Interleukin-13 induces mucin5AC production involving STAT6/SPDEF in human airway epithelial cells[J].Cell Commun Adhesion,2011,17(4-6):83-92.

[收稿2017-04-11 修回2017-05-09]

(編輯 許四平 劉格格)

ContainmenteffectsofbittertastenativeingredientfromtraditionalChinesemedicineonairwayinflammationprocessviabittertastereceptorpathway

LIUMei-Hua,ZHOUXiang-Dong,LIQi,LIUFeng,WANGJie,ZHONGYou-Qing.

DepartmentofRespiratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofHainanMedicalCollege,Haikou570102,China

Objective:To investigate the anti-inflammatory effects of bitter taste receptor (TAS2Rs) in the treatment of chronic airway inflammation by bitter Chinese medicine.Methods: The experiment was divided into three groups (n=8),namely blank control group,PM2.5 group (the rat models of chronic airway inflammation were established by aerosolized PM2.5 suspension ) and PM2.5+limonin group (intervening with the extract from Tangerine peel).The expression of mRNA and protein of inflammatory cytokines and TAS2Rs in bronchial/pulmonary tissue were detected by ELISA,RT-PCR and Western blot respectively.Results: The mRNA and protein expression levels of TNF-α and IL-13 in PM2.5 stimulated group were significantly higher than those in control group,while the TAS2R14 were not significantly changed.The mRNA and protein expression levels of TNF-α and IL-13 in the limonin intervention group was lower than that in the PM2.5 group,and the TAS2R14 were significantly increased.Conclusion: The production and release of inflammatory cytokines in the chronic inflammatory airway can be curbed by inhaling the components of bitter Chinese herbal medicine.And then,the TAS2Rs in the lungs can be activated by the bitter components to increase its expression.Therefore,it is considered that bitter Chinese herbal medicine to play the airway anti-inflammatory effect is achieved through the activation of the airway TAS2Rs.

Bitter taste receptor;Bitter Chinese herbal;Inflammatory cytokines;Airway inflammation

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.011

①本文為國家自然科學基金(81660010，81611530713)、海南省自然科學基金(2016-8305)、海南省教育廳科研課題(Hnky2016-35)和海南醫學院大學生創新課題。

劉美花(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事慢性氣道炎癥性疾病的發生及干預方面的研究。

及指導教師：周向東(1963年-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事慢性氣道炎癥性疾病的發生及干預方面研究，E-mail:zxd999@263.net。

R56

A

1000-484X(2017)09-1331-05