不同程度病變宮頸組織miR-424表達水平及其臨床意義

欒 磊 關淑芬 朱 越 楊可欣

(齊齊哈爾醫學院附屬第一醫院婦科，黑龍江 齊齊哈爾 161041)

不同程度病變宮頸組織miR-424表達水平及其臨床意義

欒 磊 關淑芬 朱 越 楊可欣

(齊齊哈爾醫學院附屬第一醫院婦科，黑龍江 齊齊哈爾 161041)

目的探討微小RNA(miR)-424在宮頸上皮內瘤變(CIN)和宮頸癌患者宮頸組織中的表達情況及其臨床意義。方法齊齊哈爾醫學院附屬第一醫院就診并最終獲得宮頸組織病理學診斷的40～69歲女性患者，收集宮頸組織；采用實時熒光定量PCR檢測不同病變程度宮頸組織中miR-424的相對表達水平并進行比較。結果共收集129例不同程度病變患者的正常和病變宮頸組織樣本(CIN Ⅰ組25例，CIN Ⅱ組30例，CIN Ⅲ組28例，宮頸癌組46例)。不同病變程度宮頸組織中miR-424的表達差異有統計學意義(F=47.009，P=0.000)，且隨著病變程度的增加，miR-424的表達水平呈下降趨勢。miR-424高表達所占比例與宮頸組織病變程度相關(χ2=8.377，P=0.039)，而與人乳頭瘤病毒(HPV)感染情況不相關。結論miR-424在不同病變宮頸的表達水平存在差異，隨著宮頸病變程度的加重，其表達水平呈降低趨勢，并且宮頸病變程度影響miR-424的表達水平。

微小RNA(miR)-424;宮頸組織

微小RNA(miRNA)是一種短鏈非編碼的小分子RNA，通過與靶基因轉錄生成mRNA的特異性結合來發揮基因表達的轉錄后調控作用，從而參與細胞增殖、分化、凋亡等生物過程〔1〕。研究〔2〕表明，miR-424在高級別宮頸上皮內瘤變(CIN)和浸潤性宮頸癌的宮頸脫落細胞中的相對表達水平顯著低于低級別CIN和正常宮頸脫落細胞中的表達。許君芬等〔3〕對正常宮頸和宮頸癌組織的miRNA表達譜分析結果顯示，miR-424是表達下降最明顯的miRNA。本研究擬分析miR-424在不同病變程度宮頸組織中的表達及其與各臨床參數間的關系。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2013年7月至2015年12月來齊齊哈爾醫學院附屬第一醫院就診并最終獲得宮頸組織病理學診斷的40～69歲女性患者129例，收集病變部分宮頸組織及其病變周圍正常宮頸組織用于miRNA檢測。組織標本取出后立即放入液氮中并置于-80℃冰箱中保存，直至RNA提取。排除標準：①既往已被確診為CIN、宮頸癌或其他惡性腫瘤者；②既往行宮頸部分或全部切除而致的宮頸不完整者；③孕婦均知情同意。宮頸組織的病理學診斷是通過手術切除或宮頸活檢獲取的宮頸組織經過石蠟切片的蘇木素-伊紅(HE)染色，診斷依據2003年國際腫瘤研究機構出版(IARC)的乳房和女性生殖器官腫瘤的病理和遺傳學相關依據進行診斷〔4〕。當研究對象同時存在多級別宮頸病變時按最高級別入組。CIN Ⅰ組25例，CINⅡ組30例，CINⅢ組28例，宮頸癌組46例。平均年齡分別為(49.61±4.55)歲、(52.03±5.36)歲、(50.54±5.91)歲、(51.86±6.25)歲。4組年齡分布差異無統計學意義(F=2.210,P>0.05)，具有可比性。本研究經我院醫學倫理委員會批準。

1.2實驗步驟 ①總RNA提取：取出冷凍的病變宮頸組織及病變周圍正常宮頸組織進行勻漿，采用Trizol法提取宮頸組織中的總RNA〔5〕；然后向提取出的RNA沉淀中加入10 μl焦炭酸二乙酯(DEPC)水(日本TaKaRa公司)，于冰上靜置30 min以充分溶解RNA，置于-80℃冰箱保存備用。②逆轉錄合成cDNA：向200 μl的滅菌管中加入0.5 μg上述步驟提取的總RNA和適量DEPC水，使總體積為6.8 μl，70℃在PCR儀器上預變性10 min保持4℃；向上述完成預變性的滅菌管中繼續加入以下試劑：逆轉錄酶(日本TaKaRa公司)0.8 ml，逆轉錄緩沖試劑(日本TaKaRa公司)2.0 ml，RNA酶抑制劑(日本TaKaRa公司)0.2 ml，各基因RT引物0.2 ml，使總體積為10 μl；在PCR儀(美國BioRAD公司)中完成逆轉錄反應，反應程序：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，4℃ forever。③實時熒光定量PCR：向96孔板(美國Axygen公司)中加入qPCR反應體系(上、下游引物各0.4 μl，2×SRBR Premix Taq 10 μl，Rox reference Dye 2 0.4 μl，3H2O 7.8 μl，cDNA模板1.0 μl)，使總體積為20 μl；反應程序：95℃ 30 s，(95℃ 5 s + 60℃ 30 s)×40 個循環，其中，SRBR Premix Ex Taq試劑盒來源于日本TaKaRa公司。U6上游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′,下游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-5′；miR-424上游引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTCA AA-3′，下游引物：5′-CGAAGCAGCAGCAATTCATG-3′。

1.3結果判讀 采用7900HT快速實時系統自帶的SDS軟件進行結果分析。用2-△Ct代表miRNA的相對表達水平，其中△Ct=Ct(miRNA)-Ct(U6),以U6作為對照。數值越大表示檢測的miRNA的相對表達水平越高，越小表示相對表達水平越低。

1.4統計學方法 應用SPSS17.0軟件行方差分析、χ2檢驗。

2 結 果

2.1miR-424在宮頸組織中的表達 除CIN Ⅰ組外，CIN Ⅱ組、CIN Ⅲ組和宮頸癌3組正常宮頸組織與病變組織中miR-424表達水平均有統計學意義(P<0.05)，且病變組織中miR-424的表達水平均低于正常組織。在正常宮頸組織中miR-424的表達在各組間的差異均無統計學意義(P>0.05)。而在病變宮頸組織中miR-424表達水平在CIN Ⅰ組與CIN Ⅱ組、CIN Ⅲ組與宮頸癌組差異顯著(P<0.05),而CINⅡ組與CINⅢ組差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2Spearman相關分析 miR-424在CIN Ⅰ、CIN Ⅱ、CIN Ⅲ和宮頸癌中的表達具有相關性(r=-0.784，P<0.05)，且隨著宮頸病變程度的加重，miR-424的相對表達水平顯著性降低。

表1 各組正常、病變宮頸組織miR-424表達情況

2.3miR-424相對表達水平與不同程度宮頸病變患者臨床資料的關系 不同程度病變宮頸組織中病變組織/正常組織比值≥0.5為miR-424高表達；<0.5為低表達〔5〕。在CIN Ⅰ、CIN Ⅱ、CIN Ⅲ和宮頸癌4組宮頸組織中，miR-424低表達所占比例分別為52.0%(13例)、63.3%(19例)、75.0%(21例)、82.6%(36例)。miR-424的表達情況與宮頸病變程度顯著相關(χ2=8.377，P=0.039)。此外，miR-424的表達情況與患者人乳頭瘤病毒(HPV)感染情況不相關(χ2=2.553,P=0.110)，其中HPV+97例，低表達72例；HPV-32例，低表達19例。

3 討 論

宮頸癌的發病過程漫長，一般按順序要經歷HPV感染、不同程度的CIN，最后發展為宮頸癌，該過程平均需要5～20年。由于宮頸易于暴露和取材，結合宮頸癌的高發生率和較漫長的發病過程，監測宮頸不同程度病變的生物標志物(如miRNA)的發現可為宮頸癌的早發現、早治療提供依據。

miRNA是廣泛存在的由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼小RNA，主要參與基因轉錄后的表達調控。它通過與靶mRNA分子的3′-UTR特異性互補結合，在轉錄后水平調控靶基因的表達，從而參與機體細胞的增殖、分化、凋亡等多種重要的生物學過程〔6〕。miRNA的異常表達廣泛參與多種腫瘤相關基因的調控，它通過對體內促癌或抑癌基因表達的調控來發揮作用。

目前研究顯示miR-424在胃癌〔7〕、結直腸癌〔8〕、原發性肝細胞癌〔9〕、前列腺癌〔10〕等癌組織中的表達異常，提示miR-424可能參與惡性腫瘤的發生發展。Cheung 等〔11〕采用RT-PCR實驗技術在高級別宮頸上皮內瘤變和正常宮頸組織中的202個miRNAs進行表達譜分析，結果發現了12個高度差異表達的miRNAs，其中包括miR-424，并且它在宮頸鱗狀細胞癌和正常宮頸組織中的表達也存在差異。許君芬〔12〕研究發現miR-424在宮頸癌組織中的表達較宮頸正常組織顯著下調。以上研究提示miR-424在宮頸癌及其癌前病變組織中差異表達。本研究結果與Cheung等〔11，12〕研究結果一致，即miR-424在宮頸癌組織中的表達下調。以上結果提示miR-424可作為一個潛在的生物標志物，用于宮頸病變的檢測。

1Lu J,Clark AG.Impact of microRNA regulation on variation in human gene expression〔J〕.Genome Res,2012;22(7):1243-54.

2田其芳.宮頸脫落細胞microRNA檢測在宮頸癌篩查中的作用〔D〕.杭州：浙江大學,2014.

3許君芬,李 陽,王芬芬,等.miR-424在不同宮頸病變中的表達及其調節宮頸癌細胞生物學行為的研究〔C〕.杭州：2011年浙江省婦產科學學術年會暨“婦產科常見疾病的臨床研究新進展”學習班論文匯編，2011:1.

4李素萍,王興武,宋 寶,等.宮頸癌組織miR-199b表達及其臨床意義的初步分析〔J〕.中華腫瘤防治雜志,2012;19(17):1335-8.

5陳萬青,鄭榮壽,張思維,等.2012年中國惡性腫瘤發病和死亡分析〔J〕.中國腫瘤,2016;25(1):1-8.

6Bartel DP.MicroRNAs:target recognition and regulatory function〔J〕.Cell,2009;136(2):215-33.

7Wei S,Li Q,Li Z,etal.miR-424-5p promotes proliferation of gastric cancer by targeting Smad3 through TGF-β signaling pathway〔J〕.Oncotarget,2016;7(46):75185

8Jepsen RK,Novotny GW,Klarskov LL,etal.Intra-tumor heterogeneity of microRNA-92a,microRNA-375 and microRNA-424 in colorectal cancer〔J〕.Exp Mol Pathol,2016;100(1):125-31.

9Yang H,Zheng W,Shuai X,etal.MicroRNA-424 inhibits Akt3/E2F3 axis and tumor growth in hepatocellular carcinoma〔J〕.Oncotarget,2015;6(29):27736-50.

10Banyard J,Chung I,Wilson AM,etal.Regulation of epithelial plasticity by miR-424 and miR-200 in a new prostate cancer metastasis model〔J〕.Sci Rep,2013;3(17):3151.

11Cheung TH,Man KN,Yu MY,etal.Dysregulated microRNAs in the pathogenesis and progression of cervical neoplasm〔J〕.Cell Cycle,2012;11(15):2876-84.

12許君芬.miR-424及其參與的Cul2/E2F1/miR-424調控環路在宮頸癌發生發展中的作用和機制研究〔D〕.杭州：浙江大學,2014.

〔2017-02-25修回〕

(編輯 袁左鳴)

欒 磊(1978-)，女，副主任醫師，主要從事婦科醫療研究。

R737.33

A

1005-9202(2017)17-4313-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.069