溫清飲軟膏對小鼠特應性皮炎皮損表皮中間絲聚合蛋白表達的影響

于春水 楊和榮 周建瓊 胥興文

(遂寧市中心醫院皮膚科,四川 遂寧 629000)

溫清飲軟膏對小鼠特應性皮炎皮損表皮中間絲聚合蛋白表達的影響

于春水 楊和榮 周建瓊 胥興文

(遂寧市中心醫院皮膚科,四川 遂寧 629000)

目的 探討溫清飲對小鼠特應性皮炎模型皮損表皮中間絲聚合蛋白(FLG)蛋白表達的影響。方法 構建小鼠特應性皮炎模型，檢測溫清飲作用前后皮損表皮中FLG蛋白的變化。結果 溫清飲作用后小鼠特應性皮炎模型皮損表皮中FLG蛋白的表達增高，表達水平明顯高于對照組。結論 溫清飲上調小鼠特應性皮炎模型皮損表皮中FLG蛋白的表達。

溫清飲；絲聚蛋白

特應性皮炎(AD)是一種慢性、復發性、炎癥性皮膚病，該病病因和發病機制不明，研究表明，AD的發病機制涉及皮膚屏障功能、天然免疫系統和獲得性免疫系統的相互作用、相互影響和相互制約〔1〕。中醫藥在治療AD、濕疹等皮膚功能障礙性皮膚病方面療效獨特。我們前期的研究發現，川芎嗪可抑制HaCaT細胞中成纖維細胞生長因子(FGF)10 mRNA的表達〔2〕。當歸多糖(當歸的主要成分)對HaCaT細胞的增殖具有顯著抑制作用〔3,4〕。而當歸、川芎是溫清飲的組成成分之一，本文探討溫清飲對小鼠AD模型皮損表皮中間絲聚合蛋白(FLG)表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與材料 7周齡健康小鼠32只(質量約20 g，雌雄隨機)由川北醫學院動物實驗中心提供，隨意飲水、飲食。中藥材溫清飲(白芍、當歸、熟地黃、川芎、黃連、黃柏、黃芩、梔子)、單純基質以及溫清飲軟膏由川北醫學院附屬醫院藥劑科提供及制備。FLG 抗體(Goat anti mouse FLG antibody，美國Abcam公司)。

1.2 動物造模 小鼠分組及皮損誘導：將32只7周齡小鼠隨機分為4組，每組8只：正常對照組、AD模型組、溫清飲治療組、鹵米松治療組。參考DNCB誘導小鼠AD模型形成相關文獻并稍加改進〔5〕，模型組、溫清飲治療組、鹵米松治療組小鼠足墊及脫毛后背部外涂0.1%DNCB溶液100 μl，1次/w。6 w后取正常對照組和模型組背部皮膚，做HE染色，顯示模型構建成功。

1.3 給藥及皮損取材 將上述動物模型分組處理，溫清飲治療組給予溫清飲軟膏，2次/d，持續治療2 w；鹵米松治療組給予鹵米松乳膏，2次/d，持續治療2 w；正常對照組和模型組仍外涂丙酮。治療2 w后觀察各小組小鼠皮損情況，取背部脫毛處皮膚做HE染色及免疫組化實驗。免疫組化染色步驟按試劑盒說明。

1.4 免疫組織化學染色結果評分及判定 根據小鼠皮膚表皮角質層和顆粒層FLG陽性表達細胞數量進行評分從而對其結果進行半定量的評估〔6〕。顯微鏡下觀察每張切片的整體染色情況：① 200倍視野下選擇5個具有代表性的區域，每個區域共計數200個細胞，陽性細胞所占百分比計分為0～3分，若無陽性細胞記0分；陽性細胞<25%計1分；陽性細胞在25%～50%計2分，陽性細胞>50%計3分。②著色強度計分：不著色計0分；輕微著色(呈淡棕黃色)計1分；中等著色計2分；強著色(呈明顯棕黃色)及3分。最后，將以上兩部分評分分數相加，進行統計結果分析。FLG表達陽性細胞為細胞質或細胞核呈棕黃色或棕褐色。

1.5 統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

免疫組化檢測小鼠表皮FLG表達:①正常對照組及模型組皮膚表皮中均有FLG陽性表達的棕褐色顆粒，主要定位于細胞質及細胞核內，以細胞質為主；正常對照組小鼠表皮FLG彌漫分布于其表皮的角質層及顆粒層，并向棘層延伸，染色強度明顯減弱，而模型組小鼠皮損角質層及顆粒層FLG的表達明顯低于正常對照組，且在棘細胞層上部也有少量表達。溫清飲治療組及鹵米松治療組小鼠皮損FLG表達量明顯較模型組增高，甚至幾乎接近正常水平。②模型組與正常對照組陽性表達評分之間差異顯著(1.80±0.262、4.80±0.185，P<0.01)；溫清飲治療組(4.22±0.128)及鹵米松治療組(4.34±0.207)與模型組之間差異顯著(P<0.01)，但溫清飲治療組及鹵米松治療組和正常對照組無統計學差異(P>0.05)。

3 討 論

AD以劇烈瘙癢和皮膚炎癥為主要特征。AD病因十分復雜，包括遺傳、皮膚屏障功能缺陷和免疫調節異常等〔7〕。皮膚屏障功能異常在AD的發病機制中發揮著重要的作用。研究發現大多數AD患者都有FLG基因的表達降低，考慮FLG缺陷是AD發病的危險因素〔8〕。

近年來，學者們對表皮功能屏障形成中不可或缺的表皮終末分化蛋白FLG有了更深一步的認識。AD和銀屑病是兩種常見的炎癥性皮膚病，均表現為皮膚屏障功能受損〔9〕和皮損處與外周血中IL-17表達增加〔10〕。AD表皮屏障功能受損，親水性和親脂性物質的滲透增多，經皮水分丟失(TEWL)過多，使得皮膚變得干燥，缺少水分，因此維持正常的皮膚屏障功能是相當關鍵的。

小鼠FLG基因位于3號染色體，其結構與人類高度相似，且屬于EDC成員，Howell等〔11〕通過免疫組化檢測正常人及AD患者皮損處FLG表達時發現，AD患者皮損處角質層和顆粒層FLG的表達明顯低于正常人，而AD患者皮損區FLG的表達比非皮損區更低。本實驗結果表明正常小鼠皮膚表皮FLG蛋白的表達明顯高于模型組，這與Howell等〔11〕研究結果一致。FLG在維持皮膚屏障功能中發揮著重要的作用，表達降低甚至缺失與AD的發生明顯相關。經溫清飲治療后小鼠皮膚表皮FLG蛋白的表達明顯上調，說明溫清飲對FLG的表達發揮著積極的作用，溫清飲對AD模型小鼠的皮損有明顯的抑制作用，能上調表皮FLG蛋白的表達，從而使得皮膚屏障功能得以更快的修復。

1 Mc Grath JA.Profilaggrin,dry skin and atopic dermatitis risk:size matters〔J〕.J Invest Dermatol,2012;132(1):98-104.

2 于春水,譚升順,眭維恥,等.川芎嗪對HaCaT細胞中成纖維細胞生長因子10影響的實驗研究〔J〕.中國皮膚性病學雜志,2007;21(3):141-3.

3 于春水,牟韻竹,熊 芬,等.當歸多糖對HaCaT細胞中成纖維細胞生長因子10影響的實驗研究〔J〕.中國中西醫結合皮膚性病學雜志,2010;9(2):87-9.

4 于春水,牟韻竹,蘇江維,等.當歸多糖誘導HaCaT細胞凋亡的實驗研究〔J〕.中國中西醫結合皮膚性病學雜志,2010;9(3):143-5.

5 Borowski LC,Lopes RP,Gonzalez TP,etal.Is steroid resistance related to multidrug resistance-Ⅰ(MDR-Ⅰ)in rheumatoid arthritis〔J〕.Int Immunopharmacol,2007；7(6):836-44.

6 Oh SH,Bae BG,Park CO,etal.Association of stress with symptoms of atopic dermatitis〔J〕.Acta Derm Venereol,2010;90(6):582-8.

7 Kasraise S,Werfel T.Role of macrophages in the pathogenesis of atopic dermatitis〔J〕.Mediat Inflamm,2013;2013(3):942-5.

8 Sandilands A,Terron-Kwiatkowski A,Hull PR,etal.Comprehensive analysis of the gene encoding filaggrin uncovers prevalent and rare mutations in ichthyosis vulgaris and atopic eczema〔J〕.Nat Genet,2007;39(5):650-4.

9 Hvid M,Vestergaard C,Kemp K,etal.IL-25 in atopic dermatitis:a possible link between inflammation and skin barrier dysfunction〔J〕.J Invest Dermatol,2011;131(1):150-7.

10 Gutowska -Owisiak D,Schaupp AL,Salimi M,etal.IL-17 downregulates filaggrin and affects keratinocyte expression of genes associated with cellular adhesion〔J〕.Exp Dermatol,2012;21(2):104-10.

11 Howell MD,Kim BE,Gao P,etal.Cytokine modulation of AD filaggrin skin expression〔J〕.J Allergy Clin Immunol,2007;120(1):150-5.

〔2015-08-28修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

四川省科技廳資助課題(2016JY0214)；四川省衛計委資助課題(150243)；遼寧市中心醫院資助課題(2015S23)

于春水(1969-)，男，醫學博士，主任醫師，碩士生導師，主要從事皮膚屏障功能障礙。

R733.7

A

1005-9202(2017)02-0282-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.010