1例誤診為強直性肌營養不良的脊髓小腦共濟失調3型患者的基因診斷

黃朱亮 肖勁松 鄧倩昀 李祖華 鄭 芳 △

1)武漢大學中南醫院臨床基因診斷中心/檢驗科 武漢 430071 2)武漢大學中南醫院神經內科 武漢 430071

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1例誤診為強直性肌營養不良的脊髓小腦共濟失調3型患者的基因診斷

黃朱亮1)肖勁松2)鄧倩昀1)李祖華1)鄭 芳1) △

1)武漢大學中南醫院臨床基因診斷中心/檢驗科 武漢 430071 2)武漢大學中南醫院神經內科 武漢 430071

目的 探討基因診斷在臨床誤診為強直性肌營養不良的3型遺傳性脊髓小腦共濟失調家系中的價值。方法 收集家系成員外周血，提取基因組DNA，全基因組外顯子測序篩查致病基因。PCR擴增患者遺傳性脊髓小腦共濟失調3型致病基因片段，電泳和測序鑒定異常電泳條帶。結果 基因診斷確診該患者為遺傳性脊髓小腦共濟失調3型，并非強直性肌營養不良。該患者致病基因為雜合子，CAG重復次數分別為21次和71次。結論 外顯子組測序技術在孟德爾遺傳病中尋找致病基因發揮了重要作用以及基因診斷對不典型脊髓小腦共濟失調有很好的確診價值，對于臨床出現相類似的癥狀的患者或與其他疾病癥狀相疊加的脊髓小腦共濟失調的患者，均應進行基因診斷，以免出現漏診和誤診。

全外顯子測序；脊髓小腦共濟失調3型；強直性肌營養不良；基因診斷

遺傳性脊髓小腦共濟失調(spinocerebellar ataxia，SCA)是一組常染色體顯性遺傳的進行性神經系統變行性疾病，主要涉及小腦、錐體系、錐體外系、運動神經元等多系統的損傷與功能障礙。脊髓小腦共濟失調3型(SCA3)/馬查多-約瑟夫病(Machado-Joseph disease，MJD)是遺傳性脊髓小腦共濟失調最為常見的一種，臨床表型主要為進行性小腦失調、構音障礙、飲水嗆咳、眼球震顫、癡呆等。SCA3是由于位于14q32.1的染色體編碼ataxin-3(ATXN3)蛋白基因第九號外顯子末端CAG重復次數異常擴增引起的，形成含多聚谷氨酰胺尾的異常蛋白[1]。正常人CAG重復次數為12～44次。SCA3臨床表型多樣性，近些年來有少數報道臨床癥狀類似于帕金森病最終診斷為MJD[2]。少數SCA3臨床癥狀僅僅只是表現錐體外系的癥狀，然而小腦失調的癥狀并不明顯，尤其是在早期難以與臨床有相類似癥狀的疾病，如帕金森癥、舞蹈病、運動遲緩癥等區分開來，到疾病晚期SCA的特有癥狀才明顯[3]。因此，有必要加深對SCA早期臨床癥狀的表型認識與研究。

由于千人基因組計劃為人們提供了豐富的遺傳學變異數據，且全外顯子測序技術主要用于測序基因組的外顯子和附近部分DNA區域，對常見或罕見遺傳性疾病的致病基因篩查。近些年全基因組外顯子測序快捷，費用下降被廣泛應用于遺傳領域的研究，極大提升了基因突變的檢出率，對家族遺傳性疾病的致病基因具有快速篩查的作用。本文對一家系應用外顯子組測序技術對其致病基因進行初步篩查和分析，首次發現1例臨床誤診為強制性肌營養不良的病例，并經基因診斷確診。

1 對象與方法

1．1 對象 患者32歲開始發病，出現不明原因的運動遲緩，四肢活動不靈活伴無力，雙手握緊后難以迅速松開，肌肉僵直，四肢近端肌肉輕度萎縮，臨床診斷為強制性肌營養不良，患者病情進行性加重20多年。近期其女兒攜帶患者血樣和視頻來我院進行基因診斷，全身四肢肌肉明顯性萎縮，反應遲鈍，神情呆滯，雙手握緊后，肌肉僵硬，難以舒展開，下肢痙攣性癱瘓，無法行走，偶有飲水嗆咳、構音障礙等臨床癥狀體征。

1．2 方法

1．2．1 全血基因組DNA的提取：抽取患者和健康人外周靜脈2 mL全血，EDTA抗凝，采取SDS裂解法從全血中提取基因組DNA。

1．2．2 全基因組外顯子測序：將患者提取的基因組DNA，送華大基因公司外顯子測序。使用BGI exome kit(59M)捕獲平臺進行外顯子組捕獲后，Illumina HiSeq 2000測序平臺測序，并對測序結果進行分析。

1．2．3 PCR擴增和電泳：設計合成強直性肌營養不良1型(DM1)和2型(DM2)，SCA3引物(擎科生物公司合成)，引物序列見表1。PCR擴增DM1、DM2、SCA3基因位點，采用50 μL體系，反應程序：95 ℃，5 min，35×(95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s)，72 ℃ 5 min。PCR產物采用2%瓊脂糖凝膠電泳，120 V，15 min置于紫外分光儀拍照判斷結果。

1．2．4 PCR產物測序：將PCR產物送擎科生物公司測序，計算相應基因位點的三核苷酸的重復次數，判定結果。

表1 引物序列

2 結果

2．1 家系系譜圖 Ⅰ1為先證者，Ⅱ1為先證者女兒，26歲目前沒有臨床癥狀。見圖1。

圖1 家系系譜圖

2．2 外顯子測序 數據過濾和篩選原則：(1)選取功能性的變異如外顯子區域、剪切位點等，去掉同義突變位點。(2)過濾掉千人基因組計劃和dbSNP數據庫已報道的SNP位點。(3)SIFT軟件對突變位點的氨基酸功能是否改變進行預測，優先考慮蛋白功能預測結果為損毀性的。(4)同時在6萬人的基因組數據庫ExAC(http：//exac.broadinstitute.org/)再次篩選。(5)選取表達在大腦和周圍神經的突變位點進行優先篩查。(6)突變位點與臨床表型有共分離的現象。根據以上的數據處理原則，未發現新的突變位點。見表2。

表2 全外顯子基因組數據篩查的結果

2．3 PCR產物電泳和測序結果 患者DM1和DM2型目的基因PCR產物電泳結果：目的片段均在正常范圍內(見圖2)。患者SCA3目的基因PCR產物，電泳結果：一條帶在正常范圍，另外一條帶異常(見圖3)。測序結果正常條帶SCA3的CAG重復次數為21次，異常條帶的重復次數為71。經過基因檢測，患者并非為強直性肌營養不良，確診為遺傳性脊髓小腦共濟失調3型。其女兒CAG的重復次數為20次和71次，為SCA3，目前沒有臨床癥狀。

圖2 M泳道：marker，1泳道：患者DM1型條帶，2泳道：患者DM2型條帶，3泳道：正常人DM1型條帶，4泳道：正常人DM2型條帶，5泳道：空白對照

圖3 M泳道：marker，1泳道：患者SCA3條帶，2泳道：正常人SCA3條帶，3泳道：空白對照

3 討論

SCA3是在遺傳性脊髓小腦共濟失調中最為常見的一種亞型，其臨床特征主要以進行性小腦共濟失調為主，在中國人中發病率約占所有SCA患者的50%。但同時有文獻[4]報道SCA3的臨床表型不一，部分患者臨床主要表現為錐體束的癥狀，肌肉萎縮，肌張力異常，出現帕金森病的癥狀或舞蹈病體征，甚至出現痙攣性截癱等臨床癥狀，而小腦共濟失調的主要癥狀不明顯[5]。甚至有的患者只是表現為單純性痙攣性截癱，卻沒有共濟失調的癥狀[6]。本研究首次發現1例臨床癥狀類似于強制性肌營養不良的患者，患者主要臨床癥狀表現為全身四肢肌肉明顯性萎縮、僵硬、雙手握緊之后很難再舒展開、運動遲緩、神情呆滯，發展到晚期甚至出現痙攣性癱瘓、無法行走等非共濟失調的癥狀和體征，經DNA全外顯子測序排除由于其他基因的突變引起，基因檢測最終才得以排除患者不是強直性肌營養不良而是SCA3。

全外顯子測序是應用下一代測序技術對基因組的編碼區進行測序，篩選外顯子的突變位點。在人類中外顯子組總共有180 000個，總全基因組約為1%(30 Mb)[7]，且在孟德爾遺傳性疾病中約85%的疾病突變位點位于外顯子區域[8]。在單基因遺傳性疾病致病基因定位中，傳統的方法是通過基因連鎖分析確定疾病的突變位點，但如果家系人數有限或外顯不全經常會無法定位和篩選到突變位點，因此全外顯子測序作為一種新的致病基因定位技術，逐漸開始被應用于臨床致病基因的定位和臨床基因診斷。2009年，在《Nature》雜志[9]發表了一篇文章，第一次應用該技術對4例弗里曼謝爾登綜合征患者中篩選出致病基因MYH，說明該項技術可以用臨床單基因病遺傳病的突變位點檢測。近年大量文獻[10]報道，應該全外顯子測序技術發現疾病新的突變位點，如研究者在2個肢成骨不全病例中，發現該病新的突變位點位于PDE4D，甚至在1個Shprintzen-Goldberg syndrome 患者中用外顯子測序發現新的突變位點位于SKI基因[11]。所以，本文中對該病人采用全外顯子測序篩選疾病的突變位點，經該方法排除患者存在強直性肌營養不良的已知突變位點或新的突變位點，確認患者并非強直性肌營養不良，經基因診斷確診患者為SCA3[12]。全外顯子測序具有所需樣本例數小、費用低、快速、高通量測序的特點，被廣泛應用于單基因基因，復雜性疾病甚至癌癥的致病基因或易感基因的查找。基于這些，《Science》雜志將外顯子組測序技術評為“2010年世界十大科技進展”之一。

SCA由于含有很多亞型，且臨床表型復雜多變，導致一些非典型的SCA在早期無法與一些有相類似癥狀體征的神經系統疾病區分開。本研究首次發現1例臨床癥狀類似強直性肌營養不良的SCA3，臨床醫生出現誤診，經基因診斷才確診為SCA3。該病例加深與豐富了我們對SCA疾病臨床癥狀多樣性的理解，通過該病例的報道也會給臨床醫生的診斷提供一定借鑒、參考作用，同時補充了SCA罕見表型的相關臨床資料，讓我們對SCA疾病有更全面的認識。因此，建議在臨床出現類似的癥狀時，或SCA癥狀有疊加時，應制定更加詳盡的基因診斷策略進行基因診斷排查與確診，避免出現誤診、漏診。

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(收稿2016-02-25)

Gene diagnosis of one case with spinocerebellar ataxia type 3 misdiagnosed as myotonic dystrophy

HuangZhuliang*，XiaoJingsong，DengQianyun，LiZuhua，ZhengFang

*CenterofClinicalGeneDiagnosis，ZhongnanHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430071，China

Objective To investigate the gene diagnostic value of one case with spinocerebellar ataxia type 3 misdiagnosed as myotonic dystrophy．Methods Genomic DNA was extracted from family and exome sequencing was performed to screen pathogenic gene，which was amplified by PCR technique．Then abnormal electrophoretic band was identified by electrophoresis and sequence．Results The patient was definitely diagnosed as spinocerebellar ataxia type 3 rather than myotonic dystrophy．Pathogenic gene was heterozygous，which showed 71 and 21 times of CAG repeats．Conclusion The whole exome sequencing plays an improtant role in discovering disease-causing mutations coincident to Mendelian inheritance and the gene diagnosis has a good clinical diagnostic value in atypical spinocerebellar ataxia．The patients with similar clinical symptoms or spinocerebellar ataxia should received gene exanimation in order to avoid the misdiagnosis and missed diagnosis．

Whole exome sequencing；Spinocerebellar ataxia type 3；Myotonic dystrophy；Gene diagnosis

R744

A

1673-5110(2016)24-0021-03

△通訊作者：鄭芳，E-mail：zhengfang@whu.edu.cn