分子生物學技術在轉基因食品檢測領域中的研究進展

沈 泓，李 超，李 玨

（浙江省食品藥品檢驗研究院，杭州 310052）

分子生物學技術在轉基因食品檢測領域中的研究進展

沈 泓，李 超，李 玨

（浙江省食品藥品檢驗研究院，杭州 310052）

近年來，隨著基因工程技術的發展，轉基因食品也隨之快速發展起來，但轉基因食品在為人類帶來巨大經濟效益的同時，也存在著安全隱患。因此，高效、便捷的轉基因食品檢測技術顯得至關重要。文章從基因水平、蛋白質水平兩個方面，介紹了多種轉基因食品檢測技術，并對這些方法的基本原理、優缺點及存在的問題等方面進行了具體分析。

轉基因食品 檢測 基因 蛋白質

轉基因食品（Genetically Modified Food）是指利用基因工程手段，將一些有利于人類生產的外源基因轉入動物、植物或者微生物中，改變其遺傳特性，從而獲得原物種所不具備的性狀、營養價值、品質特征[1]。因此，轉基因食品又可分為轉基因植物、轉基因動物、轉基因微生物食品[2]。從1983年P. Zambryski等用T載體將外源基因轉入植物細胞基因組從而得到第一株轉基因植物以來[3]，轉基因食品的研究與應用越來越受到關注。轉基因油菜、玉米、棉花、南瓜等幾十個農作物品種被相繼開發，這些轉基因作物具有抗除草劑、抗蟲、抗病毒等多種不同性狀的外源基因[4]。

然而，雖然轉基因食品的逐漸商業化為滿足人們日益增長的物質需求提供了新的途徑，但轉基因食品在食用安全性、對生態環境的影響等方面一直頗受爭議[5]。轉基因食品是利用基因工程改變原物種遺傳物質的新技術，轉基因過程中的各個環節都有可能產生安全隱患[6]，例如經過DNA重組后的物種可能會合成具有毒性的蛋白質；轉基因物種所表達的蛋白可能會影響人的免疫系統等。我國是轉基因作物種植大國，種植面積位居世界第六。同時，我國也是轉基因食品進口大國，研究顯示我國進口轉基因大豆累計達2億t，市場上70%的豆制品中含有轉基因成分[7]。因此，建立高效、快速、準確的轉基因食品定性、定量檢測方法，是滿足廣大消費者知情權和選擇權的需要，更是加強轉基因食品安全監管的重要技術支撐[8]。該文主要對目前分子生物學技術在轉基因食品檢測中的應用進行詳細闡述。

1 基因水平的檢測

轉基因技術是指通過基因工程手段對生物體內DNA分子進行修飾改造從而改變原物種遺傳性狀。基因水平的檢測主要是利用PCR法、分子雜交、基因芯片等方法檢測遺傳物質中是否存在外源基因[9]。

1.1 基于PCR的檢測方法

1.1.1 定性PCR法

為了使外源基因能被順利轉入宿主體內并有效地表達，轉基因一般需要構建啟動子、終止子、選擇性標記基因、報告基因[10]，其中啟動子和終止子是目的基因表達必不可少的序列。據研究，絕大部分轉基因作物含有啟動子CaMV 35S、終止子NOS和抗性基因NPTII3這3個基因元件。針對啟動子、終止子、選擇性標記基因等設計引物，通過PCR擴增這些序列，可鑒定出食品中是否含有轉基因成分[5]。國內，倪賢生等利用花椰菜花葉病毒35S啟動子和根瘤農桿菌NOS終止子設計了特異性引物對35S、NOS，以PCR擴增技術成功檢測出轉基因大豆。國外，Shirai等[11]用該方法成功檢測了抗草甘膦的轉基因大豆Rounfup Ready。但定性PCR法只是對轉基因產品的初步檢測，某些植物或土壤微生物中也會含有CaMV 35S和NOS基因元件，因此該方法有假陽性的可能。

1.1.2 多重PCR法

多重PCR技術，又稱復合PCR技術，是1種在1個PCR反應體系中加多對引物，同時擴增多個靶序列的技術。常規PCR技術由于受到引物的限制，1次只能檢測1個目的片段，如需要檢測多個目的片段則需要進行多次PCR檢測。而多重PCR法可通過1次擴增，檢測多個靶基因片段，相較于常規PCR法既節約成本，又大幅提高檢測效率，其檢測效果也更為可信[12-13]。目前多重PCR技術已用于多個轉基因作物品種的檢測，且隨著對定量檢測的需求，該技術也被發展用于定量檢測。2005年，Hiroshi Akiyama等[14]成功將多重定量PCR技術應用于擁有不同性狀的轉基因玉米的檢測。張平平等[15]以大豆外源凝集素基因和肌動蛋白基因作為內部對照以評價多重PCR反應的效率，結果顯示當轉基因大豆含量僅為0.15%時，仍可以對轉基因食品進行可靠的鑒定。

1.1.3 實時熒光定量PCR法

實時熒光定量PCR在常規PCR法的基礎上增加了一條帶有熒光基團的探針，其5’端帶有1個報告基團，3’端帶有1個淬滅基團。反應開始時，探針結合在目的基因上；隨著擴增鏈的形成，DNA聚合酶將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增1條DNA鏈，就有1個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步，從而對反應管中的熒光度進行實時檢測，確定反應出的DNA的量，然后通過計算機程序對獲得的數據進行處理來給出樣品中DNA的量[16]。蔡慧農等[17]將TaqMan探針應用于熒光定量PCR，成功建立了轉基因大豆和轉基因玉米的TaqMan-熒光定量PCR檢測方法。熒光定量PCR法具有污染風險小、靈敏度高、操作簡單、檢測時間短等優點。但該方法設備昂貴，單次檢測成本相對較高[18]。

1.2 基于基因芯片的檢測方法

基因芯片（Gene chip）又稱DNA微陣列（DNA microarray），是一種將大量帶有標記的基因寡核苷酸探針按特定排列方式固定于尼龍膜、硅片、玻璃等載體之上[19]，可與靶基因片段進行分子雜交，并通過掃描儀系統）檢測分子雜交信號強度，然后以計算機技術對信號進行綜合分析，即可獲得樣品中大量基因序列及表達信息，以對其進行定性及定量[5]。在食品安全領域，基因芯片技術主要被應用于食源性致病微生物快速檢測和轉基因食品的檢測。黃文勝等[20]根據目前油菜種所轉入的外源基因，以CaMV35S啟動子、FMV35S啟動子、Nos終止子、Bar、Barnase、Barstar、EPSPS、GOX、PAT和內源基因Fbp等為靶序列，設計特異性引物和探針，并制備相應的基因芯片，結合多重PCR技術用來檢測油菜樣品中所含的外源基因，1次可同時檢測10個基因，具有獨特的優勢。

2 蛋白質水平檢測

生物遺傳信息的傳遞是遵循“中心法則”的，遺傳信息由DNA轉錄成RNA，再通過RNA在核糖體中的翻譯合成對應的蛋白質，用以維持生物體各項生理功能。轉基因技術的目的是通過改變生物體DNA，使其表達人們所期望的特異蛋白質。因此，針對轉基因產品中外源基因所表達的特異性蛋白進行檢測，也可準確的鑒定出轉基因成分。目前，蛋白質水平上用于轉基因檢測的方法主要有Western印跡法、酶聯免疫吸附法、試紙條法、蛋白質芯片等。

2.1 Western印跡法

蛋白質印跡法與分子雜交原理相似，是一種結合電泳分離、特異性抗體、顯色酶促反應的技術，能夠從相對復雜的混合物中檢測出特異性蛋白質。蛋白質印跡法主要是從待測樣本中提取總蛋白，經SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳使蛋白質按分子質量大小分離后，將其轉移到固相支持物（硝酸纖維膜或尼龍膜）上，用同位素標記的抗體作為探針進行雜交，再通過放射性顯影技術檢測出食品中的轉基因成分[5]。該技術目前已被用于致病菌、轉基因食品的檢測領域，利用該方法可從植物細胞總蛋白中檢測出50 ng的特異性蛋白質，若總蛋白純度高可檢出1～5 ng[1]。據報道，蛋白質印跡法成功檢測了Roundup Ready大豆中的CP4合成酶，且檢測限達到了0.5%～1.0%[21]。但蛋白質印跡法操作過程復雜，操作時間較長，導致該技術無法成為一種高效的轉基因食品檢測方法。

2.2 酶聯免疫吸附法（ELISA）

酶聯免疫吸附法又稱為酶標法，是在免疫酶基礎上發展起來的新型免疫檢測技術，它將抗原抗體免疫反應的特異性和酶的高效催化作用有機地結合了起來。ELISA的基本原理是用固相載體吸附檢測樣品和抗體或抗原，將其與相應的美標抗體或抗原進行特異性反應形成抗體-待測抗原-酶標抗體復合物，加入酶底物后發生顯色反應，待測抗原的量與顯色產物成正比，因此可通過分析有色產物的量確定樣本中待測物的含量[22]。ELISA技術要求低，操作簡便準確，已發展成為1種應用廣泛的檢測技術手段。目前在轉基因食品檢測領域，已有多種商業化ELISA檢測試劑盒。但ELISA技術也有其缺點，就是檢測通量低，且1種試劑盒一般只可檢測1種特定的轉基因產物，檢測成本相對較高[8]。

2.3 蛋白質芯片

蛋白質芯片技術在原理上與基因芯片技術大致相同，將蛋白質檢測試劑或檢測探針以陣列形式固定在玻片、硅片、纖維膜等固相載體上，將從待測樣品中提取的總蛋白與蛋白芯片進行孵育反應，帶有熒光標記的靶蛋白分子與芯片中的分子發生特異性反應，通過對熒光信號強度進行檢測，可判斷食品中是否含有待檢的目標蛋白及其含量，由此推斷食品中是否含有該蛋白對應的轉基因成分及其含量[5]。汪琳等[23]建立了1種抗體蛋白芯片檢測方法，可同時檢測BT Cry1Ac 蛋白、植酸酶蛋白、BT Cry1Ah 蛋白的這3種轉基因成分。蛋白質芯片技術有著特異性強、檢測效率高的優點，但也有著一些需要解決的問題，如芯片制造成本相對較高，固定于載體表面特異外源蛋白容易失活，靈敏度低等。

2.4 試紙條法

試紙條法主要是將特異性抗體交聯到試紙條和顯色物質上，當試紙條上的特異性抗體與抗原物質結合后再與帶有顯色物質的抗體發生免疫反應，形成雙抗夾心結構并在紙上顯色，若不含有抗原則不顯色。可根據轉基因食品中所包含的外源性蛋白設計相應抗原，制備檢測試紙條。該法操作簡便，成本低廉，且不需要儀器設備，非常適用于現場檢測。但試紙條法也存在著些許不足，如檢測靈敏度低，當轉基因食品中外源基因表達量低時，無法進行有效檢測；經過加工的轉基因食品其蛋白質結構容易受到破壞，從而影響檢測結果的準確性[24]。

3 結語

隨著基因工程的快速發展，越來越多轉基因食品流入市場，轉基因食品在滿足各種特定需求的同時，其安全性也越來越受到人們關注。對轉基因食品進行有效標識和合理監管的前提就是要對轉基因食品進行有效檢測。因此，建立起快速、準確、簡單、高效的、適用性廣的轉基因食品檢測技術至關重要。核酸、蛋白質等大分子物質是特異性檢測轉基因食品的理想物質，隨著分子生物學技術的發展，轉基因檢測技術也有了極大的發展。除了該文介紹的技術，還有許多從分子水平出發檢測轉基因的新技術，如巢式和半巢式PCR[25]、生物傳感器技術[26]、PCR-ELISA法[27]、免疫PCR法[28]等。轉基因食品檢測方法多種多樣，但所有的方法都各有優缺點，需要不斷完善和改進。隨著技術的進步，會有更多先進的轉基因食品檢測技術出現。

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