生物素對蛋雞代謝基因表達的調控及日糧推薦用量

黨曉鵬 ，劉梅

（1.陜西納米維生素工程研究中心，陜西 西安 710018；2.沈陽農業大學畜牧獸醫學院，遼寧 沈陽 110161）

生物素對蛋雞代謝基因表達的調控及日糧推薦用量

黨曉鵬1，劉梅2

（1.陜西納米維生素工程研究中心，陜西 西安 710018；2.沈陽農業大學畜牧獸醫學院，遼寧 沈陽 110161）

生物素是蛋雞正常生長發育和維持高產性能的必需營養素，作為蛋雞體內重要生物代謝酶的輔助因子在蛋雞營養物質代謝和細胞因子基因表達調控起著廣泛而又非常關鍵的作用，是蛋雞蛋白質、碳水化合物和脂肪代謝等必不可少的微量營養素。隨著蛋雞育種和集約化養殖設施設備的迅猛發展，蛋雞日糧中生物素的營養需要量不斷增高，目前推薦集約化高產蛋雞配合飼料中生物素的添加量為150～250mg/噸。

生物素；蛋雞基因表達；用量

生物素(biotin)，又稱維生素H、輔酶R、維生素B7，屬B族水溶性維生素。生物素是蛋雞蛋白質、碳水化合物和脂肪等正常代謝不可或缺的物質，是蛋雞生長發育和維持高產性能的必需營養素[1]。近年來,生物素已成為蛋雞維生素營養研究領域的熱點。

早在1936年，兩位德國科學家Kogl和Tonnis就從鴨蛋黃中分離提取出一種酵母生長所必需的結晶物質，稱之為生物素。20世紀40年代初，歐美科學家分別明確了生物素的化學結構，1944年Harris等完成了生物素的人工化學合成。生物素廣泛分布于動植物中,天然存在的生物素主要以與其它分子結合的形式存在。生物素的化學結構中包括一個含五個碳原子的羧基側鏈和兩個五元雜環,在體內由側鏈上的羧基與酶蛋白的賴氨酸殘基結合,發揮輔酶作用。生物素有8種不同的異構體,其中只有D-生物素具有生物活性。生物素在動物肝、腎、酵母（2mg/kg）及牛乳中含量較多。生物素容易同雞蛋清中一種蛋白質（抗生物素蛋白，avidin）結合，大量食用生蛋白可阻礙生物素的吸收從而導致生物素缺乏癥，如體重減輕、脫毛、皮炎、腳趾開裂、蹄病等。生物素在蛋白質、脂肪合成、糖質新生等生化反應過程中均有重要作用。生物素是多種羧化酶的輔酶，在羧化酶反應中起CO2載體的作用，是生物體固定CO2的重要因素。生物素是許多需要ATP羧化反應中羧基的載體。羧基與生物素雙環系統上的一個氮原子結合，如丙酮酸羧化酶催化丙酮酸羧化成草酰乙酸的反應。

生物素純品為無色長針狀結晶，具有尿素與噻吩相結合的駢環，并帶有戊酸側鏈。極微溶于水（22mg/100ml水，25℃）和乙醇（80mg/100ml，25℃），較易溶于熱水和稀堿液，不溶于其它常見的有機溶劑。通常條件下生物素相當穩定，但強酸、強堿和甲醛可破壞生物素,酸敗脂肪及膽堿也可使其失活，紫外線照射也能破壞生物素活性。生物素有結合和游離兩種存在形式,結合的生物素不能被蛋雞直接利用,必須在腸道經生物素降解酶分解,釋放出游離生物素后,方能被吸收利用。生物素在小腸前段以完整分子形式與特異性載體結合被腸粘膜上皮細胞主動轉運吸收，吸收后的生物素進入肝門脈循環，體內各種組織中以肝臟和腎臟中含量最高[3]。蛋雞通常不能降解生物素分子中的環結構，大部分在線粒體中通過側鏈的β氧化降解為雙降生物素，與體內多余的生物素一起隨尿液排出。至于小腸內未被吸收的生物素以及腸道遠端微生物自身合成的生物素，到了大腸部位也通過與小腸相類似的機理被機體吸收[2]。

上世紀90年代以前，國際生物素市場一直由包括德國巴斯夫、瑞士羅氏、日本住友株式會社和武田化學等幾家大公司所壟斷。自1949年羅氏集團采用Sternbach合成法，在世界首次實現D－生物素工業化合成生產以來，各國化學家對生物素合成方法開展了大量的研究，但作為工業化合成生產路線，均無明顯進展。Sternbach法工業化生產中存在著硫代反應不完全、反應條件苛刻、原料難獲取、成本高，脫芐收率低等弊端。多年來各國科學家雖試圖改進該方法，但進展緩慢。為找出一條生產成本低、產品收率高的D－生物素合成新路徑，復旦大學陳芬兒教授課題組獨辟蹊徑，刻苦攻關，終于在2001年開發成功以不對稱催化合成為核心技術的D－生物素不對稱合成新工藝。該技術以富馬酸為起始原料，經氯代、相轉移催化芐胺化和關環制得環酸，經脫水、不對稱甲酯化、還原和硫代制得關鍵手性合成硫內酯，再經格式反應、羧化、脫水、立體專一性還原成D－雙芐生物素，進而經脫芐、開環、再關環即得D－生物素。新的生物素工業化合成技術，原料易得且價格低廉，反應條件溫和，生物素產品生產成本不到國外公司的三分之一。這一生物素合成新工藝，結束了我國生物素長期依賴進口的局面，并牢牢確立了我國生物素產品在國際市場上的話語權，使我國一舉成為全球最大的生物素生產國和出口國。

1 生物素對蛋雞營養代謝和細胞因子基因表達的調控

生物素對蛋雞營養代謝基因表達的調控，主要是通過作為多種營養代謝酶輔助因子來實現的。生物素是羧化和羧基轉移酶系的輔酶,是羧基轉運的載體,這些酶系在蛋雞體內有轉移羧基和固定二氧化碳的作用。其中乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、丙酮酸羧化酶 (PC)、丙酰輔酶A羧化酶(PCC)和3-甲基丁烯酰輔酶A羧化酶(MCC)是四種代表性的羧化酶。隨著基因調控和分子生物技術的發展，人們發現生物素不僅具有這些傳統典型的酶輔助因子功能，而且還在轉錄和翻譯水平上影響蛋雞營養代謝基因的表達，實現對相關營養代謝的調控。

1.1 對蛋白質和核酸代謝基因表達的調控 生物素在蛋白質合成、氨基酸脫氨、氨基甲酞轉移以及亮氨酸、色氨酸分解代謝中起重要的作用,也是多種氨基酸轉移脫羧過程所必需。生物素缺乏會影響亮氨酸轉化為草酰乙酸的脫氨反應,體內瓜氨酸合成鳥氨酸能力降低，氨基酸結合進入肝臟、腸粘膜、胰腺和皮膚等組織蛋白質的過程被明顯抑制。若及時補充生物素,便能促進氨基酸的結合。生物素缺乏會損害組蛋白與DNA的互作,這與組蛋白的磷酸化、乙酰化和甲基化等作用有關。生物素缺乏還會導致肝臟鳥氨酸轉甲氨酰酶活性及其mRNA豐度降低，鳥氨酸轉甲氨酰酶在精氨酸代謝和尿素循環中起著很重要的作用。DNA芯片研究表明,生物素對外周血液單核細胞的多個基因表達均有影響。生物素酰腺苷酸是羧化全酶合成過程中的中間產物，生物素酰腺苷酸的合成是由羧化全酶合成酶催化的。目前認為生物素酰腺苷酸是通過一種尚不清楚的機理對可溶性鳥苷酸環化酶進行活化。鳥苷酸環化酶的活化使環鳥苷酸量增加，從而刺激蛋白激酶G產生信號傳導，蛋白磷酸化得到活化，使編碼羧化全酶合成酶、乙酰輔酶A羧化酶，丙酰輔酶A羧化酶基因轉錄活性增強。如果生物素缺乏或羧化全酶合成酶的活性降低這些基因的轉錄活性將受損。

生物素對嘌呤等核苷酸的合成也起著關鍵的作用。生物素缺乏將會損害組蛋白和DNA的互作，這與組蛋白的磷酸化、乙酰化和甲基化等有關。生物素放射性標記后發現位于細胞核內的生物素與組蛋白共價形成核蛋白，并通過磷酸化、甲基化來調控轉錄、基因沉默和DNA修復等代謝過程。

1.2 對碳水化合物代謝基因表達的調控 在碳水化合物代謝中，生物素酶完成脫羧和羧化反應。這些反應包括：丙酮酸向草酰乙酸的可逆轉化，蘋果酸轉化成為丙酮酸，琥珀酸和丙酸的相互轉化，草酰琥珀酸轉化為α-酮戊二酸以及脫羧作用的其它反應。生物素具有固定二氧化碳的生化作用。生物素缺乏降低了葡萄糖的利用率，糖酵解反應受阻，因為生物素是糖酵解過程中葡萄糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶活性激活的關鍵因子。而生物素通過誘導胰島素分泌進行碳水化合物代謝調節的機制主要有兩條途徑：一是生物素-葡萄糖激酶通路。葡萄糖激酶作為糖酵解過程核心酶之一，促進糖酵解反應生成丙酮酸。在丙酮酸脫氫酶的作用下，生成乙酰輔酶A，進入三羧酸循環，生成ATP來影響胰島素的分泌，葡萄糖激酶活性在轉錄和翻譯水平得到調控。生物素主要在轉錄階段調控其表達，并對葡萄糖激酶mRNA的表達呈現出雙向調節作用，即生物素短期作用產生刺激作用，長期作用則呈現抑制作用。但生物素通過葡萄糖激酶促進胰島素分泌，只在生物素灌流的初期發生。通過第二信使鳥苷酸環化酶(cGMP)激活cGMP依賴性的蛋白激酶，增加葡萄糖激酶mRNA的轉錄表達需要2h，而6h后葡萄糖激酶活性才呈現大幅度提高；二是生物素-丙酮酸羧化酶通路。丙酮酸羧化酶作為依賴生物素羧化酶系之一，在糖異生和三羧酸循環過程中有重要作用。丙酮酸羧化酶在胰小島里并沒有發揮糖異生的作用，因其中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的mRNA的表達及酶的活性很低甚至沒有，生物素同時也能大大降低其他組織中烯醇式丙酮酸羧激酶的活性，而磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶是糖異生過程不可或缺的關鍵酶之一，所以丙酮酸羧化酶催化生成的草酰乙酸只能進入三羧酸循環，從而產生大量的ATP。隨著ATP、ADP能量狀態的改變，激活細胞能量壓力感受器5-AMP激活性蛋白激酶，通過一系列的轉錄因子 SREBP-lc、ChREBP、NAMPT、PGC-ld 和mTORCl等來調控碳水化合物的代謝。對于離體培養的非生物素缺乏小鼠胰島細胞，10～1000nmol/L的生物素可以增加葡萄糖激酶活性和其mRNA豐度；同時胰島素的表達和分泌隨生物素的添加而提高。相反，生物素缺乏，胰臟葡萄糖激酶活性和mRNA的豐度降低至對照組的一半。中間代謝中另一個重要的蛋白質——胰島素受體也受生物素的調節。有研究發現生物素在轉錄后提高了胰島素受體水平。

1.3 對脂肪代謝基因表達的調控 在脂肪代謝中，乙酰輔酶A羧化酶催化乙酰輔酶A的羧化，其前體為丙二酰輔酶A，這一化合物的作用是能使脂肪酸鏈延長，隨后由細胞多酶復合體和脂肪酸合成酶將丙二酰輔酶A合成棕櫚酸。生物素也是合成長鏈不飽和脂肪酸的必須因子，并與膽固醇的代謝有關。脂肪代謝過程中需要乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、脂肪合成酶(FAS）、6-磷酸葡萄糖脫氫酶以及硬脂酰脫氫酶等重要酶的參與。而這些酶mRNA表達受到轉錄因子同醇調節元件結合蛋白(SREBPlc)調控。在脂肪合成代謝中，生物素通過SREBPlc激活乙酰輔酶A羧化酶，加速脂肪合成。而作為脂酸合成的限速酶，乙酰輔酶A羧化酶負反饋降低線粒體內脂酰肉堿轉移酶的活性，抑制脂肪氧化分解。同時也激活6-磷酸葡糖脫氫酶和硬脂酰脫氫酶，促進不飽和脂肪酸的合成和脂肪細胞生長。葡萄糖是脂肪合成最主要的底物，因此參與糖酵解的酶也可被看作是脂肪合成代謝的延伸。生物素一定程度上提高了糖酵解過程中葡萄糖激酶的活性，同時生物素通過刺激胰島素的分泌，激活葡萄糖載體轉運葡萄糖進質膜，協同葡萄糖磷酸化。葡萄糖磷酸化生成葡萄糖-6磷酸刺激了ACC和FAS mRNA的表達，從而促進脂肪的合成。在脂肪分解代謝中，人們發現F0X01基因能抑制糖酵解和脂肪合成相關基因的表達。肝細胞中過氧化物酶增殖體受體抑制脂肪氧化和生酮作用，有利于脂肪合成酶和硬脂酰脫氫酶的合成。生物素衍生物抑制了過氧化物酶增殖體受體 mRNA在脂肪組織中的表達及脂肪的生成，但生物素在不同組織中對過氧化物酶增殖體受體表達可能有所不同。生物素作為乙酰輔酶A羧化酶的輔酶參與脂肪酸的合成,催化乙酰CoA生成丙二酸CoA。該反應為脂肪酸合成的第一步，然后經過細胞質多酶復合體、脂肪酸合成酶，由丙二酰CoA合成棕櫚酸。在脂肪酸碳鏈的延長反應中，丙二酰ACP作為二碳單位的供給體參與反應，而丙二酰ACP來源于丙二酰CoA。生物素缺乏，脂類代謝異常,引起機體的脂肪酸組成發生變化，飽和脂肪酸合成減少，三酰甘油合成增多,使肝、腎脂肪提高。蛋雞日糧缺乏生物素，會使肝臟組織中棕櫚酸去飽和作用速率提高，棕櫚油酸增加，硬脂酸減少。生物素也是長鏈不飽和脂肪酸正常合成和脂肪酸代謝的必需物質。生物素還與乙酰膽堿的合成和膽固醇的代謝有關，缺乏生物素會降低蛋雞從亞油酸合成花生四烯酸的能力,導致亞油酸在體內累積。研究發現生物素和血清總脂、游離脂肪酸、甘油三酯和膽固醇負相關，和總磷脂濃度正相關。生物素具有降低血脂和膽固醇的作用，醫學上用于治療高甘油三酯血癥等疾病；高劑量的生物素能降低血清中甘油三脂和極低密度脂蛋白，但總膽固醇濃度不受影響。生物素對脂肪酸的組成也有重要影響。生物素能提高脂肪酸的去飽和速率，添加生物素有利于亞麻油酸和花生四烯酸的生成，減少了硬脂肪的含量。生物素缺乏時，去飽和酶活性降低，不飽和脂肪酸合成減少。

1.4 對細胞因子基因表達的調控 生物素可以在基因轉錄水平影響一些細胞因子的基因表達。添加生物素可以促進蛋雞脾臟細胞IFN-y和IL基因的表達，顯著提高其表達產物mRNA的表達水平[4]。受生物素影響的這些細胞因子在免疫功能中非常重要。如干擾素具有廣譜、間接非特異性的抗病毒活性，可誘導抗病毒基因如腺嘌呤核苷酸等的表達。IL-2可活化CD4和CD8 T細胞，促進細胞因子產生。刺激NK細胞增殖、活化，誘導LAK細胞產生。促進B細胞活化、增殖及產生抗體，激活單核-巨噬細胞系統，具有顯著的抗腫瘤作用，并能抵抗病毒性感染。IL-1使Th淋巴細胞活化成熟，使B淋巴細胞克隆擴增，激活NK細胞，在炎癥反應中結合巨噬細胞和中性粒細胞。另外，IL-1還誘導肝細胞合成急性期蛋白、成骨細胞增殖及成骨細胞，產生前列腺素。IL-4可介導B淋巴細胞的激活和B淋巴細胞的類別轉換。添加生物素可顯著提高增殖細胞核抗原基因的表達水平，顯著提高血液中B淋巴細胞的轉化效率，以及脾臟中T淋巴細胞和B淋巴細胞的轉化效率[5]。生物素缺乏將降低蛋雞免疫器官中的DNA含量和DNA的周轉代謝速度。添加生物素，能明顯提高免疫器官的DNA含量，促進DNA的周轉代謝。

1.5 對其它營養物代謝基因表達的調控 生物素作為輔酶成分還參與其它微量營養素營養代謝的基因表達調控，包括維生素B6、維生素B12、維生素C、葉酸、泛酸代謝以及溶菌酶的活化等。除此之外，生物素對角蛋白合成和表皮細胞增值分化的基因表達過程也有著極為重要的作用，能夠促進角質生成，影響表皮細胞的增值和分化，可有效預防蛋雞腳趾開裂出血以及皮炎、脫毛等病癥的發病率。

2 生物素在蛋雞日糧中的推薦用量

由于生物素在飼料原料中廣泛分布,而且蛋雞腸道微生物能夠合成生物素,過去人們曾認為蛋雞飼料中無需額外添加。隨著蛋雞育種和集約化養殖設備與環境的迅猛發展和變化,生物素對蛋雞基因表達調控的影響日趨重要。美國NRC和世界著名動物維生素營養研究機構，近年來均對蛋雞生物素營養需要量進行上調。美國NRC推薦蛋雞生物素添加量為100～150mg/噸，帝斯曼公司OVN（2016版）蛋雞飼料生物素的推薦劑量為100～150mg/噸，泰高公司（2016 版）蛋雞飼料生物素的推薦劑量為120～150mg/噸。另外，筆者統計了國內外畜牧行業期刊（2000～2016年）共計93篇有關蛋雞維生素營養論文中蛋雞配合飼料的生物素使用量，經過計算求得其平均值為112mg/噸，整體水平偏低。目前，對于集約化養殖的高產蛋雞品種，建議采用我國農業部《飼料添加劑安全使用規范》的推薦用量 150～250mg/噸。

[1]Lee Russell McDowell.Vitamins in animal and human nutrition[M].Iowa:Iowa state university press，2000.

[2]Dr.Stave Blake.Vitamins and minerals demystified[M].Mc Graw Hill Companies Inc，2008.

[3]Nabokina S M,Subramaniam V S,Said H M.Comparative analysis of ontogenic changes in renal and intestinal biotin transport in the rat[J].Am.J.Physi.Renal,2003,284:737-742.

[4]Wiedmann S，Eudy J D，zempleni J.Biotin supplementation causes increased expression of genes encoding interferon-γ，interleukin-1α，and 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase，and causesdecreased expression ofthegeneencodinginterleukin一4inhuman peripheral blood mononuclear cells[J].J Nutr.2003，133：716～719.

[5]Mallthey K C，Griffin J B，zempleni J.Biotin supply affects expression of biotin transporters，biotinylation of carboxylases，and metabolism of interleukin-2 in Jurkat cells[J].J Nutr.2002，132：887～892.

豬場、雞場未批先建能否補辦環評手續？環保部是這樣說的……

未批先建能否補辦環評手續？環保部：環保法生效前項目應限期補辦

對于“未批先建”企業能否補辦環評手續的問題，從環保部環評司獲悉，新《環保法》生效前的“未批先建”項目應限期補辦環評手續；新環保法生效后的，不再適用限期補辦手續。

2016年9月1日起實施的新《環評法》，取消了有關“未批先建”項目補辦環評手續的規定。對于“未批先建”項目接受環保部門依法處罰后是否可以辦理環評手續的問題，實際操作中存在爭論。

一種主要觀點認為，新《環保法》和《環評法》取消了“限期補辦手續”的規定。

因此，對“未批先建”建設項目，給予行政處罰后，建設單位已經付出了應有的違法代價，不應再要求建設單位補辦環評手續，而應通過排污許可證的核發等手段，將該建設項目納入日常環保監管。

另一種觀點認為，雖然法律取消了“限期補辦手續”的規定，但并不意味著補辦環評手續的完全廢止。

考慮到實踐中涉及“未批先建”的建設項目量大面廣，排污許可證的核發工作剛剛開始起步，不允許補辦環境影響評價手續，將會導致大量“未批先建”建設項目的法律地位處在不明確的狀態，也將給后續的排污許可證核發、竣工環境保護驗收等制度的執行帶來障礙，可能直接影響環保執法。

環保部環評司司長崔書紅在接受采訪時介紹，目前傾向于區分兩類情況處理。

一是對2015年1月1日新《環保法》生效前，建設單位未依法報批建設項目環境影響報告書、報告表，或者未重新報批或者報請重新審核環境影響報告書、報告表，擅自開工建設的建設項目，根據“法不溯及既往”原則，依照原環境保護法和原環境影響評價法執行，應當限期補辦環境影響評價手續。

二是對2015年1月1日新《環保法》生效后，包括2016年9月1日新《環評法》生效后的“未批先建”項目，不再適用“限期補辦手續”。但是，建設單位在接受環保部門處罰后，主動補辦環境影響報告書、報告表報請環保部門審批的，環保部門應當受理。對符合環境影響評價審批要求的，依法作出審批決定；對不符合環境影響評價審批要求的，不予批準，并依法責令恢復原狀。崔書紅還表示，環保部將在與相關方面溝通后印發文件予以規范。相關要求以正式印發的文件為準。

S816.7

A

1673-1085（2017）11-0051-05

2017-10-07

黨曉鵬，男(1966.5-)，陜西富平人。1989年畢業于西北農林科技大學，農學碩士,高級獸醫師職稱。曾獲省部級科技獎四項，發表科技論文四十余篇，參編專著三部。現任陜西省納米維生素工程研究中心副主任,西安市納米維生素工程實驗室主任，陜西金冠牧業有限公司技術總監。主要從事納米維生素和畜禽復合維生素產品研發和技術服務工作。