豬病毒病病毒樣顆粒疫苗研究進展

■文/山東綠都生物科技有限公司 于新友 李天芝山東省濱州畜牧獸醫研究院 沈志強

豬病毒病病毒樣顆粒疫苗研究進展

■文/山東綠都生物科技有限公司 于新友 李天芝山東省濱州畜牧獸醫研究院 沈志強

病毒樣顆粒(VLPs)是由病毒的一種或多種結構蛋白在異源系統內重組表達，并自動裝配成的一種不含病毒核酸的空心顆粒。與傳統疫苗相比，VLPs具有相當的免疫原性和更好的安全性而成為一種理想的疫苗形式，是最有發展潛力的新型基因工程疫苗。文章就VLPs疫苗在豬病毒病防治應用方面的研究進行綜述，以期為豬病毒病的防控工作提供新的思路。

病毒樣顆粒；疫苗；豬病毒病；防治

病毒樣顆粒 (Virus-like particles，VLPs)是由病毒的一種或多種結構蛋白在異源系統內重組表達，并在該系統內或系統外自動裝配成的一種不含病毒核酸的高度結構化空心顆粒[1]。VLPs大小介于15～400nm之間[2]，形態上類似于真正的病毒粒子，不含病毒核酸，無法復制和擴增，因此，不具有感染性，安全性好[3]。VLPs保留了天然病毒粒子的空間構象和誘導中和抗體的抗原表位，免疫原性強，可模擬病毒感染途徑，被呈遞給免疫細胞，激發機體細胞免疫、體液免疫及黏膜免疫等免疫應答。VLPs具有病原體相關模式分子的活性，也可激活固有免疫應答。VLPs疫苗作為一種新型的亞單位疫苗，具有穩定性高、免疫原性好、安全性高[4]、適宜大規模生產等優點。與傳統疫苗相比，VLPs具有相當的免疫原性和更好的安全性而成為一種理想的疫苗形式，自問世起就受到了普遍關注，VLPs在結構上允許外源基因或基因片段的插入而形成嵌合型VLPs，并將外源性抗原展示在其表面。此外，多數病毒VLPs還具有包裹核酸或其他小分子的能力，可作為基因或藥物的運載工具[5,6]，是研制安全高效的預防病毒性疾病的潛在候選疫苗。迄今為止，國內外針對VLPs進行了大量的研究，本文就VLPs在豬病毒病防治應用方面的研究進行綜述，以期為豬病毒病的防控工作提供新的思路。

1 VLPs的免疫機制

與其他亞單位疫苗和重組蛋白疫苗相比，VLPs的免疫原性更強，可誘導機體產生體液免疫應答反應，主要是VLPs的抗原表位與天然病毒類似，并高度模仿了天然病毒的空間構象，表面有可被B淋巴細胞表面受體識別的成分，活化B淋巴細胞，上調組織相容性復合體MHCⅡ類分子水平，刺激機體產生特異性中和抗體，從而誘發免疫反應。外源的VLPs也能通過交叉提呈的方式，通過MHC-Ⅰ類途徑進行提呈，從而活化CD8 T細胞，實現CD8細胞介導的保護性免疫反應，這對于清除細胞內的病原體(如病毒等)至關重要。因在遞呈給樹突狀細胞加工、被MHC II類分子展示以及直接引起樹突狀細胞成熟和遷移的過程中，VLPs的大小適合被樹突狀細胞(DCs)通過吞噬、滲透及TLR受體介導等方式高效攝取，所以具有一定的免疫佐劑分子效應，單獨免疫動物就能誘導機體產生較強的免疫應答反應。VLPs能模擬天然病毒的體內感染過程，從而激活抗原遞呈細胞，尤其是進入DCs后，能上調DCs的數量并促進其成熟，使其細胞表面分子如CD40、CD80、CD86及MHC-Ⅰ和Ⅱ類分子表達水平明顯上調，同時促進DCs分泌IL-6、IL-10、MIP-1α及TNF-α等細胞因子，從而誘導機體產生細胞免疫應答。

2 豬病毒病病毒樣顆粒疫苗研究進展

2.1 豬圓環病毒病

豬圓環病毒2型(PCV2)是引起仔豬斷奶后多系統衰竭綜合征的主要病原，此外，PCV2還與豬呼吸道綜合征、豬皮炎與腎炎綜合征和繁殖障礙以及腸炎等疾病有關，是一種免疫抑制性疾病，給世界養豬業造成嚴重的經濟損失[7]。趙曉云等[8]根據大腸桿菌密碼子使用頻率表優化合成PCV2 NJ株ORF2基因，將其插入原核表達載體pQZ1，鑒定陽性后轉入表達宿主菌BL21，對重組菌進行誘導表達。SDS-PAGE結果表明，PCV2 NJ株優化的ORF2基因在大腸桿菌中得到了高效表達，表達產物以完全可溶性形式存在于菌體超聲波破碎后的上清中。Western-blotting分析結果顯示，表達的重組Cap蛋白能夠與PCV2陽性血清發生反應，電鏡觀察，可見大量直徑在17nm左右的PCV2 VLPs存在于超聲破碎后的上清中，500μg/頭重組VLPs疫苗免疫豬產生較高的抗體水平，單次免疫后21d抗體100%達到合格，對PCV2強毒的攻擊提供完全保護。Chi等[9]采用同源重組技術構建了含PCV2的Cap基因的重組PRV病毒株gE(-)/PCV2cap(+)PRV。通過間接免疫熒光試驗(IFA)和Westernblotting方法證實，重組病毒復制過程中可表達Cap蛋白。電子顯微鏡結果顯示，所表達的Cap蛋白能組裝成VLPs。用純化的VLPs免疫小鼠和豚鼠可產生針對PCV2 Cap的特異性免疫應答。

2.2 豬口蹄疫

口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄動物常發的一種烈性傳染病，豬口蹄疫臨床表現主要為蹄冠、趾間、蹄踵皮膚發生水泡和爛斑，部分豬口腔黏膜和鼻盤也有同樣病變。潘群興等[10]將O型FMDV VP1中編碼T細胞表位肽(aa21-aa40)序列連接于PPV VP2的5'端，并插入到桿狀病毒供體質粒pFastBacHTA中，構建成重組轉座載體pFastBac-FMDVVP1-PPV-VP2，轉化含有穿梭載體Bacmid的大腸桿菌感受態DH10Bac中，經藍白菌落篩選獲得重組桿狀病毒表達質粒rBac-FMDV-VP1-PPVVP2，轉染昆蟲草地夜蛾細胞(Sf9)，并在Sf9中進行了表達。電鏡觀察顯示，表達的重組蛋白能自我組裝成病毒樣顆粒，用IFA、Western-blotting分析表明，表達產物具有與PPV VP2天然蛋白相似的免疫原性。小鼠免疫試驗證實，在低濃度FMDV抗原下能夠產生特異性T淋巴細胞增殖反應，而且該病毒樣顆粒能誘導機體產生抗FMDV特異性細胞免疫反應。

董艷美等[11]根據豬源FMDV VP1上第141～160位氨基酸序列設計引物，利用重疊延伸PCR技術將該序列插入在大腸桿菌噬菌體MS2外殼蛋白基因的特定位點。然后連接到原核表達載體pET28a上，構建了重組表達質粒28a-CP-VP1，轉化BL21，ITPG誘導表達得到融合表達的CPVP1蛋白，透射電子顯微鏡下觀察融合蛋白CP-VP1成類VLPs狀。間接ELISA實驗證實，該蛋白能夠特異地結合豚鼠抗O型FMDV的陽性血清，30μg的CP-VP1的VLPs蛋白免疫小鼠后，可以誘導其產生高效價的特異抗體。竇小龍等[12]為制備Asia 1型FMDV雙層結構病毒樣顆粒，選擇牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)流行株核心蛋白p14的第169～270位氨基酸FMDVAsia1/JS/CHA/05結構蛋白VP1的第1～211位氨基酸，兩者之間設計柔性肽連接，人工合成p14-柔性肽-VP1融合蛋白編碼序列，全基因長990bp。合成基因與枯草芽孢桿菌表達載體p7257-P43連接，構建成表達質粒p7257-P43-P14-VP1。轉化枯草芽孢桿菌WB800，經篩選、鑒定，獲得表達4-VP1融合蛋白的枯草芽孢桿菌。該重組表達菌在含有40μg/mL氯霉素的LB中培養后，菌體超聲破碎可檢測到目的蛋白。Western-blotting結果顯示，該蛋白能特異性識別Asia 1型FMDV抗體，具有良好的反應原性。電鏡觀察顯示，融合蛋白組裝為直徑約50nm大小的VLPs。

盛蓉等[13]以兔出血癥病毒(RHDV)衣殼蛋白VP60為載體，分別在RHDV衣殼蛋白的C端、N端、306和307位氨基酸之間插入FMDV B細胞表位(VP1 200-213aa)，得到嵌合 VP60 基因。利用桿狀病毒表達系統表達嵌合蛋白，分別命名為VP60-2F、VP60-306F和VP60-578F。通過電鏡觀察嵌合蛋白自聚為病毒樣顆粒的能力，動物免疫試驗結果顯示，將病毒樣顆粒免疫小鼠后均可產生針對VP60和B細胞表位特異的免疫應答。

2.3 豬細小病毒病

豬細小病毒病是由豬細小病毒(PPV)引起的母豬繁殖障礙性疾病，主要臨床表現為流產、產死胎、產畸形胎、胎兒木乃伊化和不孕等，初產母豬受到的危害最為嚴重[14]。VP2是PPV的主要衣殼蛋白，具有良好的免疫原性，當用體外表達系統表達時能自我裝配形成VLPs。另外，VP2蛋白可以作為一種抗原的轉運載體，攜帶外源表位，組裝成嵌合表位VLPs，嵌合表位VLPs免疫動物具有雙重的免疫效果。Antonis等[15]用桿狀病毒產生豬細小病毒樣粒子，用低于1μg的該VLPs以油包水的形式分別免疫豚鼠和豬，均產生了很高的血清抗體滴度，僅用0.7fg豬細小病毒樣粒子免疫母豬，一次免疫就可以保護胎兒不受致死劑量的PPV的攻擊。

陳楊[16]擴增了PPV SC1株VP2基因，將其插入真核表達載體pPI-2.EG-FP中，構建轉移載體pPI-2.EGFP.VP2。采用脂質體介導法將豬偽狂犬病病毒(PRV)SA215株DNA與pPI-2.EGFP.VP2DNA共轉染Vero細胞獲得重組病毒PRV SA215/VP2株。以兔抗VP2的多克隆抗體建立的免疫熒光技術可檢測到Vero細胞發出的特異性熒光，表明PPV VP2成功插入到PRV SA215基因組中，并獲得表達。進一步電鏡觀察表明，感染PRV SA215/VP2的Vero細胞中可同時觀察到PRV與PPV兩種VLPs。徐志文等[17]構建了含 PCV2 ORF2 基因和 PPV VP2基因的重組質粒pEGFP-VP2.ORF2，由脂質體介導轉染Vero細胞，對轉染細胞進行電鏡檢測，結果觀察到VLPs存在。將純化后的VLPs免疫仔豬，檢測其血中T淋巴細胞的動態變化以及血清抗體水平。結果免疫仔豬的CD3、CD4 T淋巴細胞在外周血淋巴細胞中的比率均有一定程度的升高，CD8 T淋巴細胞在免疫后7～14d有所下降，之后再升高。抗體檢測結果表明，免疫動物血清中有較高水平的PPV、PCV2特異性抗體。

2.4 豬乙型腦炎

日本腦炎(JE)是由乙型腦炎病毒(JEV)引起的感染性疾病，JEV可引起母豬繁殖障礙，給養豬業帶來巨大損失。JEV基因組為單股正鏈RNA，全長約11kb，含有3個結構蛋白，衣殼蛋白(C)、膜前體蛋白(prM)和包膜糖蛋白(E)。其中prM蛋白成熟后被剪切成M蛋白，與病毒感染能力相關，是病毒誘發保護性免疫的重要協同成分，可產生微弱的中和抗體。E蛋白為糖蛋白，是誘導產生中和性抗體的主要抗原成分，可介導膜融合，引起血凝反應。張艷芳等[18]將乙型腦炎病毒prME及其信號肽基因片段克隆到穿梭載體AcBacmid中，構建重組穿梭載體AcBac-prME。其轉染Sf9細胞，獲得重組桿狀病毒Ac-prME。Western-blotting、間接免疫熒光試驗及電鏡觀察，證實Ac-prME介導prME在Sf9細胞中高效表達，且形成了病毒樣顆粒。小鼠免疫和攻毒試驗表明，該病毒樣顆粒免疫可以使小鼠獲得有效抵抗乙型腦炎病毒強毒株攻擊的能力，保護率高達100%。

2.5 豬繁殖與呼吸綜合征

豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的母豬繁殖障礙性疾病，臨床表現主要為流產、產死胎、弱胎、木乃伊胎，妊娠母豬的后期流產，流產率可達30%以上，小豬的死亡率在35%～40%。PRRSV可經口腔、鼻腔、肌肉及生殖道等多種途徑感染豬發病。王璐等[19]為構建高致病性PRRSV(HP-PRRSV)VLPs疫苗，以HP-PRRSV CQ株的GP5和M蛋白的全部編碼基因為模板，利用桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統能夠成功地共表達重組質粒pFastBac1-GP5-M的GP5蛋白和M蛋白，并能自動裝配成VLPs，電鏡觀察到VLPs的直徑約為50nm，該VLPs與天然蛋白類似的免疫原性。

呂鳳林等[20]公開了一種PRRSV VLPs的研究方法。該疫苗是由PRRSV GP5、M、N3種蛋白構成的VLPs，動物試驗結果表明，形成的VLPs加入或不加入佐劑制備的注射劑型、滴鼻劑型、飲水劑型，免疫不同時期的豬群都能夠安全有效地預防PRRSV感染。Nam等[21]利用桿狀病毒表達載體，在Sf9昆蟲細胞中同時表達GP5和M蛋白，成功制備出PRRSV VLPs，用蔗糖梯度離心方法對其進行純化，并用不同量 (0.5μg、1.0μg、2.0μg、4.0μg)純化后的蛋白混合弗氏佐劑免疫小鼠，檢測血清抗體效價和細胞因子IL-4、IL-10、IFN-γ水平，結果顯示，該疫苗可以有效引起機體的細胞免疫和體液免疫，其中GP5抗體效價顯著高于陰性對照，免疫4.0μg劑量的IFN-γ水平顯著高于陽性對照，但陽性對照的IL-4、IL-10細胞因子水平高于試驗組，同時只在免疫2.0μg和4.0μg VLPs的小鼠體內檢測到中和抗體水平。

2.6 豬瘟

豬瘟是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種豬急性、熱性、高度接觸性傳染病，在世界范圍內廣泛流行，其發病率和死亡率均高，對養豬業危害十分嚴重。范京惠等[22]構建了含CSFV的優勢T細胞表位E290和PPV VP2基因的重組PM-VP2-E290，與Bac-N-BlueDNA共轉染昆蟲細胞sf9，獲得重組桿狀病毒將傳3代的重組桿狀病毒接種于形成50%單層的sf9細胞，應用免疫電鏡對表達產物進行觀察，可見到許多VLPs，表明目的基因在桿狀病毒表達系統中得到了表達，且表達的蛋白能自我裝配成VLPs，大量表達VLPs后，在無佐劑參與的情況下，按確定的免疫程序免疫6～8周齡的BALB/c小鼠，檢測小鼠的細胞免疫和體液免疫學指標。結果表明，該VLPs不僅能誘導小鼠機體產生抗CSFV的特異性CTL反應，還能刺激小鼠產生抗PPV的特異性中和抗體。

2.7 豬傳染性胃腸炎

豬傳染性胃腸炎(TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)引起的一種以嘔吐、水樣腹瀉、脫水為主要特征的高度傳染性疾病，各種不同品種和月齡的豬都能感染，2周齡受到的危害最為嚴重，死亡率可高達100%。冷勇等[23]構建了含TGEV M和sM結構蛋白基因的重組桿狀病毒rBac-M和rBac-M-sM，將重組桿狀病毒rBac-M和rBac-M-sM分別感染sf9昆蟲細胞，進行VLPs的體外組裝試驗。結果表明，M蛋白在sf9細胞內單獨表達，M蛋白和sM在sf9細胞內共同表達，都可形成TGEV VLPs，而且病毒粒子大小不等，直徑在61～101nm。

2.8 豬流感

豬流感(SI)是由豬流感病毒(SIV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性呼吸道傳染病。各種日齡和品種的豬均易感，臨床上主要表現為發病急、呼吸困難、咳嗽、流淚、鼻液增多、衰竭、低死亡率等[24]。在我國豬群中流行的血清型主要是H1N1、H1N2和H3N2。Quan等[25]用桿狀病毒表達系統表達了H1N1流感病毒血凝素和基質蛋自，共同感染昆蟲細胞后形成VLPs。用該VLPs肌注免疫小鼠，僅免疫1次，即可誘導小鼠產生以IgG2a為主的抗體反應，并且產生很高的血凝抑制滴度和記憶性IgG和IgA反應，更重要的是低劑量的VLPs就可產生抵抗致死劑量病毒感染的保護作用。

3 小結與展望

VLPs作為一種新型亞單位疫苗，具有多種優點，不含有病毒核酸，不具有感染性，能模擬天然的病毒粒子，易被免疫系統識別，不需要佐劑，低劑量免疫后就能刺激機體產生良好的免疫應答發應，因此，在某種程度上，有替代傳統疫苗的潛力，在動物疾病的防治方面有廣闊的應用前景。但在VLPs的研制過程中也存在一些問題，首先，VLPs疫苗的設計、表達、組裝及純化等對技術條件要求比較高，而且不是所有病毒都能組裝成VLPs。其次，當組裝多種蛋白形成的病毒樣粒子時，各個基因表達量的比例難以控制，表達不同蛋白的載體進入同一細胞的幾率小，產生VLPs的幾率相對降低，建立多基因共表達載體的難度大。另外，某些蛋白可能對細胞具有毒性，使其表達量較低，甚至引起其他蛋白的表達量降低，從而導致VLPs裝配效率的下降。再次，如何有效放大工藝水平、提高VLPs的組裝效率、降低成本等方面也存在著諸多挑戰。最后，VLPs采用不同的免疫途徑，免疫效果不同，需要對不同的VLPs的免疫途徑進行研究，找出最佳的免疫途徑。發展多樣的VLPs疫苗將是一個趨勢。VLPs作為一項新興的技術，在新型豬病疫苗的研制中代表了一種非常有前途的研究方向，相信通過個各國專家學者的共同努力，在不久的將來，VLPs疫苗必將為豬病毒病的防控提供新的技術手段。■

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