應用M48磁珠試劑盒提取牙齒DNA

程 沖 陳啟鳴

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應用M48磁珠試劑盒提取牙齒DNA

程 沖 陳啟鳴

泉州市公安局刑偵支隊

：應用M48磁珠試劑盒提取牙齒DNA，并評價其應用價值。：對實驗室日常受理的6例牙齒，分別采用有關文獻提出的QIAquick?PCR純化試劑盒方法和M48磁珠試劑盒提取牙齒DNA。：6例牙齒采用兩種方法檢出結果一致，但是M48磁珠試劑盒提取牙齒DNA過程較簡單、時間短。結論：M48磁珠試劑盒可以應用于牙齒DNA提取，并能大大減少實驗人員工作量。

法醫物證 牙齒 DNA提取

牙齒DNA含量較骨骼少，但是牙齒外層由牙釉質和牙本質包裹，能夠抵抗外界環境的影響破壞，使得DNA不易被降解，而且牙齒易于提取、包裝。因此，在一些白骨化案件中，牙齒的DNA檢驗經常用于尸源認定。筆者采用M48磁珠試劑盒提取牙齒DNA，獲得了較好的結果，報道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本

本實驗室日常受理的牙齒6份。

1.2 儀器和試劑

9700型擴增儀（AB公司）；3130XL型測序儀（AB公司）；M48磁珠（Qiagen公司）；Identifiler Plus試劑盒（AB公司）；骨骼孵育液（Promega公司）；EDTA緩沖液（Promega公司）；QIAquick?PCR純化試劑盒（Qiagen公司）。

1.3 方法

1.3.1牙齒DNA的提取

（1）取牙齒1顆用清水洗凈表面，用手術刀片刮去牙齒表層及污垢物，再用無水乙醇泡洗1次，去除殘余的水份，用濾紙拭干。將牙齒放入砸牙器中用錘子砸成粉末，取100mg左右牙粉置于1.5mL離心管中。

（2）加入300μL骨骼孵育液、500μL EDTA緩沖液和20μL 20mg/mL PK，20μL 1 mol/ LDTT，56℃孵育6h以上。

（3）離心管快速離心后，吸取上清液600μL至15mL 離心管內，加入M48磁珠試劑盒MTL 2mL，磁珠30μL。

（4）將15mL離心管放至翻轉搖勻儀搖勻15min。

（5）將15mL離心管緊貼磁力架，顛倒2次，確保磁珠吸附在磁力架一側，小心打開蓋子，倒去吸附液。

（6）15mL離心管加入100μL無水乙醇（消泡）、800μL MW1，振蕩5s，小心將所有液體倒入1.5mL離心管中，磁力架吸棄液體，再用80%乙醇洗滌3次，打開蓋子，65℃干燥5min。

（7）將30μL 純水加入1.5mL離心管，蓋上蓋子，振蕩，65℃孵育10min，13000rpm離心1min，收集上清液4℃保存備用。

另取牙粉100mg按照文獻[1]中QIAquick?PCR純化試劑盒方法提取牙齒DNA，4℃保存備用。

1.3.2 DNA擴增及產物檢測

采用Identifiler Plus試劑盒在9700型擴增儀進行PCR擴增，擴增體系為10μL，DNA模板為1μL，擴增參數參照Identifiler Plus試劑盒操作手冊。取上述PCR擴增產物經3130XL型測序儀電泳，結果用GeneMapper ID v3.2軟件進行分析，獲得等位基因分型圖譜。

2 結果

2.1 M48磁珠試劑盒法與文獻[1]中QIAquick? PCR純化試劑盒方法結果比較

本文中，6例牙齒經不同提取方法檢驗均全部得出了一致的檢驗結果。兩種方法分別采用Qiagen公司生產的硅膜法、磁珠法提取純化DNA，比較不同提取方法的檢驗結果，M48磁珠試劑盒提取牙齒DNA操作簡單快捷，純化提取耗時30min左右，且大部分為磁珠吸附時間，人工干預少，較文獻[1]中QIAquick?PCR純化試劑盒方法節省時間，且文獻[1]中牙齒提取方法由于牙齒消化后需要純化的體系較大，牙齒消化液與PBI溶液要按體積比1:5混勻，一般混合液能達到3mL左右，需多次離心才能過濾完全部混合液，而M48磁珠方法只需1次吸附就能轉換為1.5mL小離心管，在理論上減少了交叉污染的可能。同時，經檢驗結果對比發現，兩種方法提取牙齒DNA在峰高、平衡性方面無顯著差異。

2.2 案例檢驗應用

2016年10月26日，泉州市某水庫發現一具白骨化尸體，送檢牙齒2顆。牙齒采用本文方法提取DNA，并進行STR分型檢驗，結果成功獲得STR分型（圖1），為本案尸源認定提供了重要依據。

圖1 牙齒STR分型

3 討論

M48磁珠試劑盒法提取牙齒DNA的優勢有：（1）檢材需求量少，僅需100mg牙粉即可滿足檢驗需求。（2）牙粉無需單獨脫鈣處理。（3）牙粉消化液利用磁珠吸附原理，操作簡便，節約時間。（4）離心次數少，減少交叉污染。實驗結果顯示，兩種方法檢出率一致，但M48磁珠試劑盒法在操作過程更具有優勢。

綜上所述，M48磁珠試劑盒提取牙齒DNA操作簡單，無需特殊儀器，成功率高，提取成本低廉，能滿足實際檢案的需求。

[1]凃政,劉志芳,陳松,等.牙齒的DNA提取及STR分型研究[J].刑事技術, 2007,196 (5): 9-11.