解膠劑對脫落細胞粘取器DNA檢驗的影響

張 竹 賴富平

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解膠劑對脫落細胞粘取器DNA檢驗的影響

張 竹 賴富平

龍巖市公安局刑偵支隊

：探討折疊粘膜對粘膜DNA檢驗、解膠劑對折疊狀粘膜的DNA檢驗的影響。：使用常規(guī)Chelex100法，分別提取伸展狀、折疊狀粘膜、加入解膠劑的折疊狀粘膜。：組間兩兩比較，伸展組與折疊組、H解膠劑組與折疊組、D解膠劑組之間有顯著差異；而從組間的平均峰面積看，H解膠劑組>伸展組>折疊組。：過分折疊對粘取器粘膜的DNA檢驗不利，溶解效果較強的解膠劑能更充分地釋放被粘附的脫落細胞，Chelex100法結(jié)合濾膜離心套管，能有效避免無機提取溶液消化粘膠乳化的影響。

法醫(yī)物證學 脫落細胞粘取器 DNA檢驗

脫落細胞粘取器（EZ-Tape）是提取指紋印、手套印等微量接觸類脫落細胞經(jīng)常使用的工具，但在剝離粘膜入管時，由于管內(nèi)空間狹小和粘膜自身粘性等原因，時常會粘連、纏繞、折疊成團，致使粘有脫落細胞的一面裹在內(nèi)部而影響檢驗。解膠劑（除膠劑或膠帶剝離劑）是一種合成的化學藥劑，能夠快速、便捷、有效地去除油脂、膠水等化學成分，可以溶解各種固化后的膠粘劑。本文探討折疊對粘膜的DNA檢驗是否有影響，以及解膠劑是否有利于折疊狀粘膜的DNA檢驗。

1 材料與方法

1.1 材料來源

脫落細胞粘取器：北京泰德富臣科貿(mào)有限公司，圓形，直徑2cm。

檢材制作：在粘取器粘面上均勻涂布一定稀釋度的血液樣本，陰干。

解膠劑：搜集三種市售解膠劑，瓶身標識分別為“安戈洛瞬間膠解膠劑AD-1”“匯瑞膠粘解膠劑”“北京芬格爾華英科技有限責任公司膠帶剝離劑”，分別編為D、F、H。

主要試劑和儀器：5%Chelex-100溶液、濾膜離心套管（南京多麗洋公司）、Micocon-100柱（美國Millipore公司）、ID-Plus試劑盒、9700擴增儀、3500xL遺傳分析儀[2]。

1.2 方法

1.2.1解膠劑的pH值

將解膠劑滴在pH試紙上，與標準色版比較，讀取pH值。

1.2.2解膠劑自身的DNA檢驗

采用ID-Plus試劑盒擴增解膠劑，分別編為DK、FK、HK，28循環(huán)、10μL體系，包含4μL Mix、2μL Primer、2μL H2O、2μL解膠劑。

1.2.3加入解膠劑的陽性樣本DNA檢驗

擴增“解膠劑+9947A”，分別編為D+、F+、H+，同時擴增9947A作為對照，28循環(huán)、10μL體系，包含4μL Mix、2μL Primer、2μL解膠劑（對照組為2μL H2O）、2μL 9947A。

1.2.4折疊粘膜的DNA檢驗

取制作好的粘取器10個，分為伸展組（S）和折疊組（D），每組5個。伸展組：將粘附有血液的一面朝外，伸展狀置于濾膜離心套管內(nèi)；折疊組：將粘附有血液的一面朝內(nèi)對折三次，置于消化套管內(nèi)。在上述10管內(nèi)均加入390μL 5%Chelex-100溶液、10μL PK，56℃消化3h，99℃煮沸10min，Micocon-100柱離心濃縮，ID-Plus試劑盒擴增，10μL體系（9+1），28循環(huán)[1]。

1.2.5加入解膠劑的折疊狀粘膜的檢驗

取制作好的粘取器15個，平均分為三組（J1、J2、J3），將粘附有血液的一面朝內(nèi)對折三次，置于濾膜離心套管內(nèi)，三組分別加入D、F、H解膠劑400μL，37℃溫育2h，離心去除解膠劑，并將粘膜展開，再加入390μL 5%Chelex-100溶液、10μL PK，后同1.2.4。

1.2.6 STR分型檢測及數(shù)據(jù)分析

擴增產(chǎn)物經(jīng)3500xL遺傳分析儀檢測，數(shù)據(jù)用GeneMapper ID-X軟件分析，檢測熒光強度RFU閾值設(shè)為100，計算樣本的平均峰面積（=全部等位基因峰面積之和÷32），作為DNA定量比較的參考，用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果

三種解膠劑的pH值在5～3之間，屬于酸性液體。直接擴增解膠劑，均未檢出基因型（見圖1），表明本次實驗使用的三種解膠劑內(nèi)沒有外源性人類DNA污染。加入解膠劑的9947A均未獲得STR分型，解膠劑對PCR擴增有明顯抑制。

圖1 三種解膠劑DNA檢測結(jié)果

表2中，組別之間應(yīng)用One-Way ANOVA 運算，兩兩之間比較的統(tǒng)計學差異有部分顯著（=0.05），部分不顯著，顯著差異表現(xiàn)在S組與D組之間、J3組與D組、J1組之間，而從組別間的平均峰面積看，J3組>S組>J2組>J1組>D組，詳見表1。

表1 擴增產(chǎn)物的平均峰面積（rfu）

*J1組中一個樣本管壁破損，導(dǎo)致無結(jié)果。

表2 不同組別的平均峰面積進行兩兩比較的P值

3 討論

結(jié)果顯示，S組的平均峰面積顯著高于D組，表明過分折疊對粘取器粘膜的DNA檢驗不利，提示粘有脫落細胞的一面要與提取液充分接觸，以便更好地提取到DNA模板。

實驗中，H解膠劑的溶解效果較強，粘膜的膠層全部溶解，展開完全，甚至部分底膜也被溶解，成團狀粘附在管壁上不易脫落；而D解膠劑的溶解效果較弱，37℃溫育2h，對折后的第一層仍不能展開；F解膠劑的溶解效果適中，膠層基本溶解，容易展開，同時底膜未溶解。J3組的平均峰面積顯著高于D組、J1組，表明粘膜的膠層全部溶解能更充分地釋放被粘附的脫落細胞，提高DNA回收率。實際應(yīng)用時，可適當減少解膠劑的溫育時間，在膠層全部溶解后、底膜未被溶解前，去除解膠劑，最大化地收集利用脫落細胞DNA。

濾膜離心套管的過濾器設(shè)計，使提取過程不用換管，能有效去除樣本載體和Chelex樹脂，避免無機提取溶液消化粘膜上粘膠而乳化、發(fā)白的影響[2],使獲取的DNA更純凈，最大程度富集DNA提取液，增加下一步使用Micocon-100柱離心濃縮的原液體積。

解膠劑中含有丙酮、苯等有毒溶劑，應(yīng)避免吸入，不同品牌的組成成分不同，其理化性質(zhì)有待更深入的研究。

[1] 鄭秀芬.法醫(yī)DNA分析[M].北京:中國人民公安大學出版社,2002.

[2] 王德明,顧麗華,閻建軍,等.3種提取膠帶粘面汗?jié)撝赣≈蠨NA的方法比較[J].中國法醫(yī)學雜志,2005,20(2):65-67.