多種測序技術在藥品檢測環境微生物鑒定分析中的應用

李恩澤，劉月芬，劉玉君，姜山

（青島大學附屬醫院，山東 青島 266003）

目前，藥品生產過程中總會存在微生物污染情況，而微生物的污染很容易對藥品臨床使用功效產生不良影響，因為經濟水平發展和醫療技術的限制，藥品生產過程到目前為止都是采用空氣中的浮游菌和沉降菌數量多少作為評判是否安全合格的標準[1-3]，而這一標準顯然存在較大的缺陷，即該標準無法對微生物污染進行源頭查找和污染控制。隨著生物學融入分子學的交叉發展，微生物的鑒定方法得到了大力發展，而新一代的測序技術在臨床藥品環境微生物鑒定工作中的運用推廣，也使得微生物分析工作進入到一個新的領域。基于此，我院開展本次研究工作，以期探討多重測序技術在藥品檢測環境微生物鑒定分析中的應用可行性和可靠性，為今后醫療界對環境微生物污染工作的開展提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

數碼攝影生物顯微鏡、全自動微生物生化儀、全自動革蘭氏染色儀、梯度96孔Verti PCR儀和全自動微生物基因分析鑒定系統[4-5]。

1.2 菌株來源

本次研究在持續不斷的12個月中對我院微生物實驗室環境中不同位置、研究員、實驗設備采用胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）平板，通過3種方式進行微生物樣本采集工作，這3種方式分別是：接觸碟法、空氣沉降法及擦拭法。本次研究在12個月中共獲得10株細菌和11株霉菌，對所有采集到的標本均進行純化保存，保證標本沒有相互污染。

1.3 研究方法

1.3.1 生化鑒定采用VITEK 2 Compact儀器對分離純化獲得的10株細菌開展常規生化鑒定工作，如革蘭染色鏡檢、鑒定試劑卡等鑒定方法，各鑒定過程均嚴格按照程序及儀器操作說明書操作。

1.3.2 一代測序技術的鑒定參照“1.3.1”項下生化鑒定結果對各菌株來源DNA進行PCR擴增鑒定。嚴格按照基因分析鑒定系統配套的試劑和操作程序對菌株進行DNA提取、擴增、純化等操作，并結合電泳測序結果比對數據庫進行各菌株的種、屬鑒定。

1.3.3 宏基因組測序鑒定宏基因組測序依托高通量測序平臺進行宏基因的建庫及信息分析，并對鑒定結果進行數據庫比對，以證實鑒定數據的真實性。

選擇10株細菌和11株霉菌，并采用上述3種方法進行種屬鑒定，并對3種方法鑒定結果進行統計學分析，以判定該鑒定方法的可靠性。

2 結果

2.1 10種細菌的種屬鑒定

10株細菌的一代測序鑒定與生化鑒定比較，屬水平分類一致的有4株，種水平分類一致的有4株。采用宏基因組對各菌株進行全基因組測序鑒定，共獲得了10株菌的信息，與一代測序相比，種水平一致的有5株，屬水平一致的有5株，多了5株菌的信息。見表1

2.2 11株霉菌的種屬鑒定

由表2可以看出，霉菌生化鑒定獲得5株菌信息，一代測序獲得了4株菌信息，與生化鑒定結果比較，缺失了1株菌的信息；宏基因組測序結果包含8屬和11種，8屬覆蓋了霉菌生化鑒定結果中的5株菌和一代測序的4株菌的信息，種水平全部覆蓋。

表1 一代測序鑒定與生化鑒定、宏基因組測序結果比較

表2 霉菌的一代測序鑒定和兩種宏基因組測序鑒定結果比較

3 討論

針對目前的藥物生產技術，藥品在進行生產的過程中或多或少會出現微生物污染的情況，嚴重影響藥品的質量，如果患者服用污染后的藥品，不僅達不到治療的效果，還會產生嚴重的并發癥，對患者的生命安全形成威脅，因此，針對藥品的質量檢測非常的重要[5-6]。受醫療技術的限制，藥品生產過程都是采用空氣中的浮游菌和沉降菌數量多少作為評判是否安全合格的標準[7]，這一標準存在很大的缺陷，隨著生物學融入分子學的交叉發展，微生物的鑒定方法得到了大力發展，而新一代的測序技術在臨床藥品環境微生物鑒定工作中的運用推廣，也使得微生物分析工作進入到一個新的領域[8]。

研究發現，生化鑒定的操作較一代測序和宏基因組測序簡單，但整體流程復雜，且鑒定結果簡單，只能鑒定一些具有明顯特異性種屬的菌株，而對非特異性種屬的菌株則無法鑒定。一代測序的明顯優勢就是能明確菌株的基因序列，但不能完全實現對菌株種屬特異性基因的區分和鑒定，甚至對種屬鑒定的特異性低于常規生化鑒定。正如研究結果顯示，一代測序在對部分細菌和霉菌種屬鑒定過程中，菌株種屬的鑒定信息少于生化鑒定信息。宏基因組測序是最新一代的基因測序法，該方法不但能實現對菌株基因序列的鑒定，還能區分大部分菌株的特異性基因序列，實現對未知菌株的精確區分。從研究結果來看，宏基因組測序法能對收集到的全部細菌進行種屬鑒定，對全部霉菌的種進行區分，但對部分霉菌的屬尚無法完成鑒定區分。究其原因可能有以下幾個方面：首先是菌株污染，菌株收集后的存放過程可能導致微量污染，在提取菌株基因后擴增時產生較多非特異性片段，致使無法確定特異性基因序列；其次，特異性基因序列多樣性，菌株各種屬鑒定時需要明確擴增片段的基因序列，每次擴增只能實現一個片段的富集，對多種特異性片段的種屬則無法實現；第三，菌株基因提取純度不高，即未能富集純化菌株基因，非純化的基因在經過多次擴增后產生非特異性片段，對結果的鑒定產生干擾。

綜上所述，宏基因組測序能實現對菌株種屬信息的準確區分、鑒定；常規生化可鑒定特異性種屬的菌株，但對種屬特異性不高的菌株鑒定尚顯不足；一代測序可實現菌株的基因測序，但對種屬的特異性區分能力低于生化鑒定。

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