一株鬼針草內生真菌發(fā)酵粗提液的殺線蟲活性研究

沈清清，胡展育，劉 芳

（1.文山學院 環(huán)境與資源學院，云南 文山 663099；2. 文山學院 化學與工程學院，云南 文山 663099）

植物寄生線蟲是目前世界上分布最廣、對農(nóng)作物危害最重的害蟲，也是全世界植保界最關心、最不易解決的難題[1]。目前國際上線蟲的防治方法主要有物理防治法、化學藥劑防治法和農(nóng)業(yè)防治法。但是這些方法都存在著成本大、技術手段要求高等問題，特別是化學方法會造成很大的次生災害，對其它生物的生長危害特別大。因此從安全生產(chǎn)和綠色環(huán)保的角度出發(fā)，生物防治法成為了實現(xiàn)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要方法，其中尋找產(chǎn)毒真菌，從產(chǎn)毒真菌中分離具有殺線蟲效應的活性物質是一種具有很大發(fā)展?jié)摿Φ姆乐问侄?。Stirling G等[2]2004年報道從番茄根部分離獲得一株尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），該菌株能有效抑制南方根結線蟲對番茄的侵染，其抑制率達55%；Vu T等[3]2006年報道從香蕉上分離獲得一株鐮刀菌，該菌株能有效抑制香蕉穿孔線蟲（Radopholus similis）對香蕉的侵染，其抑制率高達85%；郝菲菲等[4]2015年報道從金線蓮中分離獲得的21株菌的殺松材線蟲活性均大于50%，其中一株阿姆斯特丹散囊菌 （Eurotiumam stelodami） 和一株竹生炭角菌 （Xylariabambusicola）的殺松材線蟲活性高達100%。鬼針草（Bidens pilosa）是一種入侵物種，由于瘦果冠毛芒狀具倒刺，可附著于人畜和貨物，目前廣泛分布于我國各地且危害嚴重[5]，開發(fā)及利用其優(yōu)勢是雙贏的治理手段。最近幾年科學家們從鬼針草的水提液及其包含的各化學成分方面進行了大量的研究，但很少從其內生真菌方面進行研究。

本研究從鬼針草植株中分離到一株內生真菌，以全齒復活線蟲為靶標，對該內生真菌的殺線作用進行測定，以期為進一步開發(fā)和利用鬼針草內生真菌為生防菌提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種分離材料來源

鬼針草健康植株采自文山市區(qū)內。

1.1.2 供試線蟲

全齒復活線蟲（Panagrellus redivivus）由云南大學微生物資源開發(fā)和利用重點實驗室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基的制備

采集鬼針草健康植株，清洗曬干后稱取莖葉300 g，剪碎后放入鍋中，加入1500 mL自來水熬煮30 min，后用紗布過濾熬煮好的汁液得到鬼針草濾液，稱取22.5 g蔗糖和瓊脂27 g，加入鬼針草濾液中，加熱直至瓊脂完全熔化，后定容至1500 mL，再次過濾，分裝，121℃高壓蒸汽滅菌。

1.1.4 供試線蟲的培養(yǎng)和制備

稱取5～8 g無糖燕麥片于250 mL錐形瓶中，用10～20 mL蒸餾水浸泡6～7 min，塞好棉塞后用報紙封口，121℃下滅菌30 min，無菌操作法把全齒復活線蟲接入燕麥片培養(yǎng)基。封口后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～10 d左右。觀察到有線蟲在錐形瓶壁上爬時，取出放置于冰箱中，調節(jié)溫度為4℃保存，備用。無菌操作條件下用貝曼氏漏斗法對線蟲進行分離。

1.2 方法

1.2.1 菌種分離

采集新鮮的鬼針草植株，洗凈，切成0.5 cm左右的小塊，用75%酒精處理1 min，然后用蒸餾水沖洗3次，2%的次氯酸鈉處理2 min，蒸餾水沖洗3次，將處理好的植株塊在無菌操作條件下接種到培養(yǎng)基上，密封，放入恒溫箱中進行培養(yǎng)，恒溫箱28℃培養(yǎng)7 d后，觀察分析培養(yǎng)基上所生長的菌種，根據(jù)其菌落形態(tài)，顏色，質地等情況初步判斷菌種差異，用PDA培養(yǎng)基對不同類型的真菌進行純化后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 鬼針草內生真菌發(fā)酵粗提液的制備

純化后的菌種嚴格按照無菌操作接種在PDA液體培養(yǎng)基中，27℃、轉速200 rpm條件下置恒溫振蕩箱中培養(yǎng)4～5 d。

1.2.3 鬼針草真菌發(fā)酵粗提液對線蟲的抗性試驗

真菌發(fā)酵液離心后稀釋，設6個濃度梯度（稀釋1、2、3、5、7、9倍）和對照，各三個重復，無菌操作條件下將各濃度稀釋液裝入培養(yǎng)皿中，對照組為無菌水。把清洗好的線蟲按每皿300條的方案加入對應培養(yǎng)皿中。以上工作完成后分別在0.5、4、12、24、48 h這5個時間點進行觀察并進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。每個培養(yǎng)基觀察10個視野，把每個視野的死亡蟲數(shù)、以及10個視野死亡總蟲數(shù)進行統(tǒng)計。

判別線蟲死亡標準為針觸法，即線蟲被發(fā)酵液處理后，針觸線蟲的活動狀態(tài)，當線蟲呈僵直不動時為死蟲，線蟲呈彎曲運動狀態(tài)為活蟲。有時線蟲和供試發(fā)酵液接觸后會呈假死狀態(tài)，其處理方法是將假死線蟲挑出置于培養(yǎng)皿中，加入少許2% NaCI浸泡5 min，僵直線蟲又呈運動狀態(tài)，若5 min內無反應即可確定為個體死亡[6]。對殺線蟲活性強弱進行分級：“－”表示校正死亡率≤10%，無殺線蟲活性；“＋”表示校正死亡率為10%～30%，殺線蟲活性弱；“＋＋”表示校正死亡率為30%～50%，殺線蟲活性中等；“＋＋＋”表示校正死亡率為50%～80%，殺線蟲活性較強；“＋＋＋＋”表示校正死亡率＞80%，殺線蟲活性強[7]。

線蟲死亡率:（死亡線蟲數(shù)/供試線蟲數(shù)）×100%。

校正死亡率:［（處理組線蟲死亡率－對照組線蟲死亡率）/（1－對照組線蟲死亡率）］× 100%。

2 實驗數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件和Microsoft Excel 2007對結果進行統(tǒng)計分析，以P＜0.05為顯著差異。

3 結果與分析

3.1 內生真菌的分離

經(jīng)過分離和篩選，獲得并純化出一株供試菌株，編號為GF1。

3.2 菌株GF1發(fā)酵粗提液抗線蟲活性

表1為菌株GF1不同濃度的發(fā)酵粗提液對全齒復活線蟲的毒殺活性統(tǒng)計表，由表可知GF1菌株發(fā)酵粗提液各稀釋濃度作用0.5 h時對線蟲的毒殺活性未顯現(xiàn)，校正死亡率均小于5%，毒殺活性均為“－”；而發(fā)酵液原液在作用12、24、48 h時校正死亡率均高于90%，毒殺活性均為“++++”；稀釋9倍的發(fā)酵液在作用0.5、4、12 h時校正死亡率均低于5%，毒殺活性均為“－”，作用24 h后才表現(xiàn)出殺線蟲活性。由此可得菌株GF1發(fā)酵粗提液對線蟲的毒殺活性隨著濃度的升高而增強，而隨著作用時間的延長其毒殺活性也隨之提升。

表1 GF1菌株發(fā)酵粗提液抗線蟲活性

表2是GF1發(fā)酵粗提液時間與組別（濃度梯度）兩因素效應表， 由表分析得知時間與組別（濃度梯度）兩組因素中，因為時間類型的平方和（73183.819）大于濃度的（44549.333），所以時間是主效應。另外，從表中還可看出以時間為底F=83.39，P值等于0.000小于0.01所以在各時間段之間存在顯著差異。

表2 菌株GF1發(fā)酵粗提液時間與組別（濃度梯度）兩因素效應

圖1是菌株GF1發(fā)酵粗提液不同濃度在不同時間段的殺線作用統(tǒng)計圖。表中數(shù)據(jù)顯示，不同稀釋濃度的發(fā)酵粗提液殺線作用效果存在明顯差異，且隨著濃度的增高殺線作用不斷增強，其中原液的效果非常顯著，作用線蟲僅12 h就能達到94%的致死率，為該菌作為生防制劑的開發(fā)提供了極為有利的數(shù)據(jù)支撐。稀釋2和3倍的濃度僅經(jīng)過12 h的作用對線蟲就能達到半致死效應，而3～7倍的稀釋濃度經(jīng)過24 h的作用對線蟲也能達到半致死效應，稀釋9倍時仍具有毒殺線蟲的效果，作用48 h后能達到半致死效應。

以上結果表明該粗提液的作用效果非常明顯。測定作用12 h時發(fā)酵粗提液與全齒復活線蟲死亡關系得到回歸方程：y= 97.312x+ 7.6452，R2=0.8639。由此得出該發(fā)酵粗提液作用12 h時對全齒復活線蟲的半致死濃度LC50=0.435。

圖 1 菌株GF1發(fā)酵粗提液不同濃度在不同時間對線蟲的作用

4 結論與討論

本試驗從鬼針草植株中篩選到一株內生真菌即GF1菌株，其發(fā)酵粗提液對全齒復活線蟲的毒殺活性效果顯著，原液作用線蟲僅12 h就能達到94%的致死率，活性隨著濃度的升高而增強，隨著作用時間的延長毒殺活性也隨之提升，表明該菌作為生防菌株具有較高的開發(fā)價值，其研究數(shù)據(jù)為后續(xù)殺線活性物質的分離奠定了基礎。

植物體內存在著大量的內生真菌，其存在的主要意義就是產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物以抵抗病蟲害對植物的侵染[8]，目前各國都在爭相研發(fā)和利用“環(huán)境和諧-相容農(nóng)藥”[9]，以實現(xiàn)國家的可持續(xù)發(fā)展，因此開發(fā)植物內生真菌為生防菌種具有巨大價值和意義。菊科植物對環(huán)境適應能力強，其中具有殺線蟲活性的種類很多[9]，鬼針草屬菊科植物，張?zhí)熘萚10]2010年對鬼針草殺線活性進行了測定，研究表明作用48 h后鬼針草提取物毒殺線蟲的校正死亡率達62.04%，其毒殺效果顯著，而本研究中從鬼針草分離獲得的GF1菌株同樣具有較強的殺線活性。內生真菌與植物長期協(xié)同進化過程中，可產(chǎn)生與其相同或相似的具有殺線活性次生代謝產(chǎn)物[1]，本文研究結果啟示我們可將菊科植物作為重要的材料資源，以獲得更多具有毒殺線蟲活性的內生真菌。

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