PARP-1蛋白在鎘致NRK-52E細胞凋亡中的作用研究

張繪艷 ， 羅通旺 ， 嚴 磊 ， 楊小康 ， 顧建紅 ， 袁 燕 ， 卞建春 ， 劉宗平 ， 劉學忠

(揚州大學獸醫學院 江蘇省動物重要疫病與人畜共患病防控協同創新中心, 江蘇 揚州 225009)

聚ADP核糖聚合酶(PARP)是一類蛋白質翻譯后修飾酶，主要存在于真核細胞的細胞核中。PARP在DNA受損時被激活而且與DNA的損傷程度呈正相關，雖然PARP激活促進了DNA的修復，但是過度的活化卻會引起細胞能量的耗竭最終導致細胞死亡[1]。目前人們發現 PARP家族共有18位成員，而應答DNA損傷的主要是PARP-1，占據PARP蛋白在細胞內90%以上的活性[2]。根據文獻報道，近幾年發現一種新的細胞死亡方式Parthanatos就是由于PARP-1蛋白的過度表達所引起[3]。

Cd是一種有毒的重金屬，可以通過食物鏈進入機體，攝入過量的Cd對機體的危害極其嚴重，會導致腎臟、肝臟、肺臟、骨骼等組織器官的損傷，對免疫系統也具有毒性效應，嚴重危害了人體健康[4]。因此，很多實驗室對Cd的致病機理展開了研究，發現Cd可以導致機體發生氧化應激并激活多條凋亡通路[4-6]。腎臟是Cd最主要的蓄積部位，其毒性損傷尤為嚴重，近年來國內外對Cd致腎臟損傷的研究常有報道[7]，但是Cd致腎臟損傷的潛在機制還不是很明確，因此本研究以大鼠腎小管上皮細胞系NRK-52E為模型，探究Cd致腎臟損傷的毒性機制以及PARP-1蛋白在此過程中發揮的作用，為進一步揭示Cd對組織器官的毒性損傷機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料 NRK-52E細胞系(上海中科院細胞庫)；DMEM培養基、胎牛血清(美國 Invitrogen公司)；RIPA 裂解液和蛋白酶抑制劑(北京普利萊基因技術有限公司)；細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒；線粒體膜電位檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒、BCA試劑盒(碧云天股份有限公司)；AO-EB雙染試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；兔抗PARP-1多克隆抗體(德國Santa Cruz 公司)；兔抗AIF多克隆抗體、兔抗β-actin單克隆抗體、兔抗Histone-H3單克隆抗體(美國CST公司)；醋酸鎘、NAC和DPQ(Sigma 公司)；實時無標記細胞功能分析儀(RTCA SP; 美國艾森生物公司); TE 2000-U 倒置熒光顯微鏡(日本 Nikon公司)；酶標儀(Tecan，Australia公司)；SG603A-HE型生物安全柜(美國Thermo公司)；二氧化碳恒溫培養箱(美國 Thermo公司)；電泳儀、電泳槽(美國Bio-Red公司)；Milli-Q Biocel型超純水系統(美國Millipore公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養 NRK-52E細胞系培養在DMEM培養基中(含有10%胎牛血清、100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素)，放置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度下的二氧化碳恒溫培養箱中培養。當細胞處于對數生長期且生長狀態良好時進行相關試驗。

1.2.2 RTCA技術分析Cd對細胞增殖的影響 RTCA技術是將微電極列陣整合在細胞培養板的每個細胞生長孔底部，可以實時、動態、定量的跟蹤細胞形態和增殖分化的改變并顯示在電腦上。試驗時首先向E-Plate檢測板中加入100 μL DMEM培養基并測定背景阻抗值。收集對數生長期細胞并計數，調整好細胞懸液濃度后向E-Plate檢測板中加入100 μL NRK-52E細胞懸液(約1×104個細胞)，將加入細胞的E-Plate檢測板放入培養箱中的檢測臺上，靜置30 min后開始實時動態的細胞增殖檢測。待細胞長到對數生長期時，將各培養孔中的培養基換成不含血清的培養基，用不同濃度的Cd處理或先用NAC預處理細胞30 min然后再進行Cd孵育并繼續進行實時動態檢測。

1.2.3 Western Blot檢測相關蛋白的表達 按照試劑盒說明書的步驟提取NRK-52E細胞的細胞核蛋白與細胞漿蛋白，各組取等量的蛋白樣品(20～40 μg)進行SDS-PAGE電泳；將凝膠上的蛋白轉印至PVDF膜，轉印完成后PVDF膜用5%脫脂奶粉溶液(TBST配制)室溫封閉90 min；加入一抗(1∶1 000稀釋)并放置于搖床上4 ℃孵育過夜；TBST洗滌6次，每次 5 min；洗完后加入HRP標記的二抗(1∶5 000稀釋)并常溫孵育2 h；再用TBST洗滌6次，每次5 min；顯影并用Image Lab軟件測定蛋白條帶的灰度并進行統計學分析。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡、細胞內活性氧水平以及線粒體膜電位的變化 將細胞接種在DMEM培養基中培養至生長對數期時，將培養基更換成無血清的培養基并進行分組，在對應組中先用DPQ預處理細胞30 min然后進行Cd孵育，孵育時間為12 h。用0.25%胰蛋白酶消化并收集細胞，流式細胞儀檢測細胞凋亡、細胞內ROS以及線粒體膜電位。

1.2.5 免疫熒光檢測線粒體膜電位 當細胞培養至生長對數期時，進行分組并處理：對照組、陽性對照組、染Cd組(5 μmol/L孵育12 h)、Cd+NAC組(100 μmol/L NAC預處理30 min后用5 μmol/L Cd孵育12 h)、NAC組(100 μmol/L NAC孵育12 h)。孵育結束后按照試劑盒說明書裝載JC-1探針并利用熒光顯微鏡進行觀察和拍照。在線粒體膜電位較低時JC-1以單體的形式存在并產生綠色熒光；在線粒體膜電位正常時JC-1以聚集物的形式存在，此時能夠檢測到紅色的熒光。

1.2.6 AO-EB試驗檢測細胞凋亡 將細胞接種于6孔板中培養，當細胞密度達到70%左右時，設置組別并進行處理：對照組、染Cd組(5 μmol/L孵育12 h)、Cd+NAC組(100 μmol/L NAC預處理30 min后用5 μmol/L Cd孵育12 h)、NAC組(100 μmol/L NAC孵育12 h)。孵育結束后按試劑盒說明書進行染色并拍照。AO(吖啶橙)可以透過完整的細胞膜，與雙鏈DNA結合后使正常的細胞呈現均勻的綠色熒光。凋亡早期的細胞其細胞膜完整而細胞核發生固縮，因此核染色質會著綠色并呈固縮狀； EB(溴化乙錠)不能透過完整的細胞膜，所以正常的細胞不能被 EB 染色，只能透過細胞膜受損的細胞并與核DNA結合呈現橘紅色熒光；凋亡中期的細胞膜通透性增加，因此EB能夠進入細胞核并與DNA 結合，呈現出鮮紅色，與 AO 同時染色后細胞會呈現橘色的熒光；凋亡末期的細胞由于細胞膜完整性遭到破壞，大量的EB進入細胞核使紅色熒光強于綠色熒光，最終細胞呈現紅色熒光。

1.3 統計學處理 蛋白條帶用ImageJ軟件分析灰度值，數據用Spass22統計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并進行多重比較。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。統計結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果

2.1 Cd對NRK-52E細胞具有毒性作用并影響了細胞的增殖 利用實時細胞分析議檢測不同濃度的Cd對NRK-52E細胞增殖的影響，結果如中插彩版圖1所示。結果表明，在Cd孵育的早期，染Cd組的指數高于對照組，但隨著染Cd濃度和孵育時間的增加，細胞指數逐漸降低，在孵育5 h之后呈現明顯的時間依賴性和濃度依賴性。

圖1 鎘對細胞增殖的影響

2.2 Cd促進PARP-1的表達以及細胞凋亡 我們用不同濃度的Cd處理細胞12 h，提取細胞蛋白并用Western Blot方法檢測PARP-1和AIF蛋白的表達情況，結果如圖2(A和B)所示。隨著染Cd濃度的增加，細胞漿以及細胞核中的PARP-1和AIF呈升高的趨勢，并且AIF的核轉位也具有濃度依賴性。另外，我們用PARP-1的特異性抑制劑DPQ干預Cd孵育的過程，然后用流式細胞術檢測細胞的凋亡變化情況，結果如圖2(C和D)所示。結果顯示，與對照組相比，染Cd組的細胞凋亡率從11.05%升高到28.16%；加人DPQ干預后與Cd組比較，凋亡率降至18.07%；單獨加DPQ組的細胞凋亡率為12%。

圖2 PARP-1蛋白對細胞凋亡的影響

2.3 NAC在Cd對細胞增殖的影響中發揮了重要作用 我們用RTCA法檢測了抗氧化劑NAC對NRK-52E細胞增殖的影響，結果如中插彩版圖3所示。結果顯示，加入Cd處理后細胞的增值受到了明顯的影響，而在NAC干預組中其增值情況與Cd組相比有了明顯的改善；NAC單獨處理組對細胞增殖沒有明顯的影響。結果表明，Cd通過氧化應激抑制了NRK-52E細胞的增殖。

圖3 NAC對細胞增殖的影響

2.4 氧化應激與PARP-1蛋白在Cd致細胞凋亡中發揮了重要的作用 為了進一步揭示氧化應激在這一過程中發揮的作用，我們利用免疫熒光的方法檢測了NAC對線粒體膜電位以及細胞凋亡的影響，結果如中插彩版圖4所示。經過Cd處理后大部分細胞的線粒體膜電位散失，而加入100 μmol/L的NAC干預后線粒體膜電位明顯升高(見中插彩版圖4A)。而且對照組的細胞核著綠色熒光并呈正常結構，染Cd組的細胞可見到大量的橘黃色熒光以及紅色熒光；Cd+NAC組中橘黃色熒光的細胞核減少，紅色熒光的細胞量也顯著下降：單獨加NAC組幾乎不見橘黃色或紅色熒光的細胞(見中插彩版圖4B)。另外，我們用PARP-1的特異性抑制劑處理細胞并檢測了線粒體膜電位以及細胞內活性氧的變化情況，結果如圖5所示。與對照組比較，染Cd組中喪失線粒體膜電位的細胞比例明顯升高；加入DPQ處理后，處于異常線粒體膜電位的細胞比例明顯下降(圖5A)。細胞內活性氧的測定結果顯示，抑制細胞內PARP-1蛋白的活性后，ROS的含量由單獨染Cd組的12.8%降至5.29%。

圖4 NAC對線粒體膜電位和凋亡的影響 (200×)

A：NAC對線粒體膜電位的影響 ； B：AO-EB法檢測NAC對細胞凋亡的影響

3 討論

在正常的細胞中PARP-1蛋白參與DNA損傷的修復，保持著基因組的穩定性，但會消耗ATP，而在一些病理情況下，細胞的DNA大量損傷從而使PARP-1蛋白持續活化，導致細胞內NAD+和ATP大量消耗，最終導致細胞死亡[8]。此外，在經典的細胞凋亡通路中，PARP-1作為Caspase-3和Caspase-7的切割底物參與了細胞的凋亡，并且通常把PARP蛋白的剪切認為是細胞凋亡以及Caspase-3激活的一個重要指標[9]。隨著研究的深入，人們發現PARP-1不僅作為底物參與細胞凋亡，而且當PARP-1過度表達時還可以通過損傷線粒體并釋放出AIF和Endo G等誘發非Caspase依賴的細胞凋亡[10]，本研究中我們用Western Blot以及免疫熒光等方法也證實了這一結論。

細胞凋亡是機體為了維持細胞內環境的穩定，由基因控制的自主性死亡。有研究表明，微摩爾級濃度的Cd即可以引起線粒體功能紊亂以及線粒體內物質的釋放[11]。當線粒體膜電位下降時從線粒體釋放的蛋白分子主要有細胞色素C與AIF等，其中細胞色素C從線粒體釋放出來后引發Caspase級聯反應[12]，進而引發Caspase依賴的細胞凋亡；AIF 蛋白是目前惟一確定的不依賴于Caspase家族就能夠降解DNA的線粒體下游分子[13]，從線粒體釋放出來后通過核轉位信號進入細胞核引起非Caspase依賴的細胞凋亡。在研究中我們發現Cd促進了PARP-1的表達，AIF的核轉位以及細胞凋亡(圖2)。氧化應激是體內ROS產生過多造成的一種負面影響，它可以通過線粒體、內質網以及死亡受體等通路介導細胞凋亡。正常的情況下機體內ROS的產生和清除維持在一個平衡的狀態，因此對機體不造成損害，但是Cd暴露可以引起機體ROS的大量增加并破壞正常的氧化代謝反應，進而引起氧化應激[14]。另外，氧化應激可以引起細胞內線粒體膜電位的改變，而膜電位的下降被認為是細胞發生凋亡的早期事件。在本研究中我們也檢測了抗氧化劑NAC對細胞增殖，線粒體膜電位以及細胞內活性氧的影響，發現氧化應激在Cd致NRK-52E細胞的損傷中發揮了重要的作用。

圖5 PARP-1蛋白對線粒體膜電位以及細胞內活性氧的影響

RTCA技術近年來被廣泛的應用于臨床實驗研究[15]，本文中我們也用RTCA的方法驗證了Cd對細胞的毒性作用。另外Western Blot結合流式細胞術的結果表明，在這一過程中PARP-1蛋白的大量表達促進了細胞的凋亡。但是在Cd孵育的細胞中抑制PARP-1的活性并不能完全阻止細胞凋亡，這是因為除了與PARP-1蛋白相關的通路外還有其他凋亡途徑也參與了Cd致細胞的損傷過程。在正常的細胞中抑制PARP-1的活性后由于阻止了PARP-1對DNA的修復，因此在一定程度上起到了促進細胞凋亡的作用。此外，在研究中我們發現用NAC處理細胞可以降低Cd導致的線粒體損傷和細胞凋亡，而且用DPQ處理細胞時也減弱了Cd對線粒體膜電位以及細胞內ROS的影響。以上結果表明，Cd能夠抑制NRK-52E細胞的增殖并且促進細胞凋亡，而氧化應激與PARP-1蛋白在這一過程中發揮了重要作用。

[1] 馬殿棟. PARP-1依賴parthanatos在脫氧鬼臼毒素誘導神經膠質瘤細胞死亡中的作用及機制研究[D].長春：吉林大學, 2015.

[2] 鄭艇. PARP-1依賴性程序性細胞死亡(Parthanatos)在布比卡因致SH-SY5Y細胞損傷中作用的研究[D].廣州：南方醫科大學, 2014.

[3] Zheng L, Wang C, Luo T,etal. JNK Activation Contributes to Oxidative Stress-Induced Parthanatos in Glioma Cells via Increase of Intracellular ROS Production[J]. Mol Neurobiol, 2016.

[4] Xia L, Chen S, Dahms H U,etal. Cadmium induced oxidative damage and apoptosis in the hepatopancreas of Meretrix meretrix[J]. Ecotoxicology, 2016, 25(5): 959-969.

[5] Chen C-Y, Zhang S-L, Liu Z-Y,etal. Cadmium toxicity induces ER stress and apoptosis via impairing energy homeostasis in cardiomyocytes[J]. Bioscience Reports, 2015.

[6] Zhang R, Zhu Y, Dong X,etal. Celastrol Attenuates Cadmium-Induced Neuronal Apoptosis via Inhibiting Ca2+ -CaMKII-Dependent Akt/mTOR Pathway[J]. J Cell Physiol, 2016.

[7] 李靜慧, 徐兆發. 鎘致腎細胞凋亡機制的研究進展及防治[J]. 毒理學雜志, 2014, 28(04): 319-322.

[8] 蔣崇貴. PARP-1/AIF通路在大鼠實驗性蛛網膜下腔出血后早期細胞凋亡中的作用和意義[D].遵義:遵義醫學院, 2012.

[9] 高貽寬. NF-κB/P65、cleaved-PARP在腦出血后神經細胞凋亡中的相關性研究[D].衡陽：南華大學, 2014.

[10] 趙偉, 高文杰, 張倩,等.PARP-1、AIF在大鼠脊髓損傷后細胞凋亡中的作用[J]. 中國組織化學與細胞化學雜志, 2015(03): 259-264.

[11] 江辰陽. 鎘致大鼠神經細胞凋亡的線粒體途徑及NAC的保護作用[D].揚州：揚州大學, 2014.

[12] 王力儉, 田可川, 吳偉偉,等. 細胞凋亡信號傳導通路的研究進展[J]. 中國畜牧獸醫, 2011, 38(10): 132-135.

[13] 張明海. 腦缺血后海馬CA1區caspase非依賴性凋亡相關蛋白表達水平的改變以及亞細胞定位[D].廣州：南方醫科大學, 2010.

[14] Zhang H, Cai C, Shi C,etal. Cadmium-induced oxidative stress and apoptosis in the testes of frog Rana limnocharis[J]. Aquatic toxicology, 2012, 122-123(67-74).

[15] Song Y, Li L, Ou Y,etal. Identification of genomic alterations in oesophageal squamous cell cancer[J]. Nature, 2014, 509(7498): 91-95.