HIF—1a、VEGF、MVD在大腸腺癌組織中的表達及臨床意義

陳寶英+王澤輝+官成濃+張英+王玉洲

[摘要]目的探討HIF-1a、VEGF、MVD（用抗CD34抗體標記）在大腸腺癌組織中的表達及與臨床病理特征的關系。方法采用免疫組織化學S-P法檢測廣東醫學院附屬醫院經病理檢查證實的手術切除標本或活檢組織中HIF-1a、VEGF、MVD的表達情況，其中38例大腸腺癌組織、22例大腸腺瘤組織、29例正常大腸組織。結果HIF-1a、VEGF在大腸腺癌組的陽性表達率分別為73.7%、65.8%，明顯高于大腸腺瘤組、正常大腸組，差異有統計學意義（P<0.05）。大腸腺癌、大腸腺瘤、正常大腸組織中MVD值分別是（52.36±9.66）、（30.23±5.22）、（21.37±4.755），MVD值在腺癌中明顯高于腺瘤及正常腸組織（P<0.05）。28例HIF-1a呈陽性表達的大腸腺癌組織MVD值為（53.22±10.15）；呈陰性表達的10例中MVD值為（42.75±10.47），呈正相關關系（rs=0.392，P<0.05）。VEGF呈陽性表達的25例大腸腺癌組織MVD值為（54.54±9.60）；呈陰性表達的10例中MVD值為（42.63±9.80），呈正相關關系（rs=0.491，P<0.05）。結論在大腸腺癌組織中HIF-1a和VEGF的表達明顯高于大腸腺瘤組織和正常大腸組織，提示HIF-1a和VEGF可能參與大腸腺癌的發展。MVD值在大腸腺癌中的表達明顯高于大腸腺瘤組織和正常大腸組織，提示大腸腺癌中血管生成較大腸腺瘤組織和正常大腸組織豐富；MVD值是衡量大腸腺癌發展、浸潤及轉移的重要指標。HIF-1a、VEGF的表達與MVD值在大腸腺癌組織中均呈正相關，提示HIF-1a、VEGF可能與大癌發展過程中血管生成密切相關。

[關鍵詞]大腸腺癌；HIF-1a；VEGF；MVD

大腸癌包括結腸癌和直腸癌，是最常見的消化道惡性腫瘤之一。雖然目前對大腸癌采用了以手術切除為主的綜合治療，但其治療效果仍不夠理想，而術后的局部復發和遠處轉移則是影響術后生存率的重要因素。因此，深入研究大腸癌浸潤和轉移的可能機制，從分子水平找到可用于提示大腸癌轉移和預后判斷的分子標志物，既可預警大腸癌的術后復發、轉移，及早對可能復發和轉移的大腸癌患者進行放化療或靶向治療，亦可研究這些因子可否成為腫瘤治療中的新靶點，對提高患者生存率、評估患者的預后及臨床治療有現實的意義。本課題運用免疫組織化學的方法檢測HIF-1a、VEGF、MVD在大腸腺癌的表達情況，并分析其相關性，探討它們與大腸腺癌臨床病理參數間的關系及在大腸腺癌中與血管生成的關系，旨在對大腸腺癌惡性程度的判定、預后分析及生物學治療提供有效的理論依據。

1資料與方法

1.1一般資料

收集廣東醫學院附屬醫院經病理檢查證實的手術切除標本或活檢組織，其中大腸腺癌38例；正常大腸組織29例（距腫瘤邊緣>5cm處的正常黏膜）；大腸腺瘤組織22例。所有標本均經40g/L緩沖中性福爾馬林液固定，常規石蠟包埋，每個標本蠟塊行4μm厚度連續切片。所有患者手術前未接受放療、化療，每例有詳細的臨床資料、手術記錄。38例大腸腺癌中男21例，女17例；年齡在29～84歲（其中≤60歲20例，>60歲18例，平均年齡59.42歲）；直腸癌16例，結腸癌22例；病理學分級：高分化5例，中分化25例，低分化8例；大腸腺癌TMN分期根據2002美國癌癥聯合會（AJCC）的分期標準進行分期：Ⅰ期6例，Ⅱ16期例，Ⅲ期15例，Ⅳ期1例；有淋巴結轉移16例，沒有淋巴結轉移22例。

1.2實驗方法

采用鏈菌素抗生物素蛋白一過氧化物酶法（S-P法）檢測μm、VEGF、CD34蛋白的表達，一抗為兔抗人HIF-1a多克隆抗體（1：50），兔抗人VEGF多克隆抗體（1：50），兔抗人CD34多克隆抗體（1：50），試劑均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3結果判斷標準

HIF-1a、VEGF表達水平采用Fromowitz陽性細胞半定量分級法。首先根據陽性細胞占整個腫瘤細胞的百分數記分：≤5%記為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。再根據陽性細胞染色深淺記分，陰性為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分，棕褐色為3分。最后將二者分數相加，0～1分記為（一），2～3分記為（+）；4～5分記為（++）；6～7分記為（+++），其中（-）～（+）視為陰性，（++）～（+++）視為陽性。

微血管計數參照Weidner的方法：任何與鄰近的微血管、腫瘤細胞及其它相連組織有明顯分界的被CD34染成棕黃色的內皮細胞或內皮細胞簇均視為一個血管計數，首先在低倍鏡（40和100倍）下選取癌視野中微血管最密集的3個區域，然后在高倍鏡（400倍）進行血管計數，取其平均值作為該例腫瘤的MVD值，結果以（x±s）表示。

1.4統計學方法

統計學處理在SPSS17.0軟件包上進行。計數資料采用x²檢驗、計量資料采用t檢驗、方差分析，分析HIF-1a、VEGF、MVD在大腸腺癌、正常大腸組織、大腸腺瘤中的表達水平，以及它們與大腸腺癌的臨床病理因素的相關性，用spearman等級相關分析HIF-1a、VEGF、MVD的相互關系，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1HIF-1a、VEGF和MVD在各種腸組織中的表達情況

2.1.1HIF-1a在各種腸組織中的表達情況HIF-1a陽性產物呈棕黃色或棕褐色顆粒，主要著色在細胞核和細胞漿，以細胞漿為主，在腫瘤壞死明顯的區域和腫瘤浸潤邊緣的表達明顯增多。在大腸腺癌、大腸腺瘤和正常大腸組織中均有表達，但表達程度不一。HIF-1a在大腸腺癌組織、大腸腺瘤組織、正常大腸組織中陽性表達率分別為：73.7%（28/38）、45.5%（10/22）、13.8%（4/29），在腺癌組織陽性表達率高于腺瘤組織和正常大腸組織，差異有統計學意義（P<0.05），在腺瘤組織與正常大腸組織間差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.1.2 VEGF在各種腸組織中的表達情況VEGF主要表達在細胞漿和細胞膜，以胞漿為主，某些血管內皮細胞也可見表達，呈棕黃色顆粒，大腸腺癌組織、大腸腺瘤組織和正常大腸組織中都有表達，但表達程度不一，高表達主要見于大腸腺癌組織。38例大腸腺癌組織中有25例VEGF表達陽性，占65.8%（25/38），VEGF在大腸腺瘤組織中陽性表達率為31.8%（7/22）及正常大腸組織中陽性率表達為10.3%（3/29）。VEGF在腺癌組織中的陽性表達率明顯高于腺瘤與正常大腸組織（P<0.05），在腺瘤組織與正常大腸組織間差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.1.3CD34在各種腸組織中的表達情況CD34定位于血管內皮細胞膜上，呈棕黃色顆粒，主要分布于癌間質區，在腫瘤周邊區含量相對高。在大腸腺癌中CD34標記的微血管形態多呈成熟狀態，管腔大，管壁比較完整，在大腸正常組織中的微血管多為單細胞形成，管腔小，形狀多不完整。大腸腺癌、大腸腺瘤、正常大腸組織中MVD值分別是（52.36±9.66）、（30.23±5.22）、（21.37±4.755）。MVD值在腺癌中明顯高于腺瘤及正常腸組織（P<0.05），腺瘤組織與正常大腸組織間差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

2.2HIF-1a、VEGF和MVD的表達與大腸腺癌臨床病理特征的關系

2.2.1HIF-1a的表達與大腸腺癌臨床病理特征的關系HIF-1a在大腸腺癌中的表達與TNM分期、淋巴結轉移、腸壁浸潤深度相關，Ⅲ期+Ⅳ期陽性表達率高于Ⅰ期+Ⅱ期（P<0.05），淋巴結轉移陽性組高于淋巴結轉移陰性組，腫瘤浸潤達漿膜及漿膜外組陽性表達率高于腫瘤浸潤未及漿膜組；HIF-1a表達與年齡、性別、腫瘤最大直徑、腫瘤部位、病理學分級無關（P>0.05）。見表4。

2.2.2 VEGF的表達與大腸腺癌臨床病理特征的關系VEGF在大腸腺癌中的表達與TNM分期、淋巴結轉移、病理學分級差異有統計學意義（P<0.05），分期晚VEGF陽性表達率高，淋巴結轉移陽性組高于淋巴結轉移陰性組，低分化VEGF陽性表達率高于中分化和高分化組；VEGF表達與年齡、性別、腫瘤最大直徑、腫瘤部位、腸壁浸潤深度無關（P>0.05）。見表5。

2.2.3MVD的表達與大腸腺癌臨床病理特征的關系MVD值與大腸腺腸癌TNM分期、淋巴結轉移、腸壁浸潤深度差異有統計學意義（P<0.05），分期晚MVD值高，淋巴結轉移陽性組高于淋巴結轉移陰性組，腫瘤浸潤達漿膜及漿膜外組高于腫瘤浸潤未及漿膜組，低分化組高于中分化和高分化組；與年齡、性別、腫瘤最大直徑、腫瘤部位無關（P>0.05）。見表5。

2.3大腸腺癌組織中HIF-1a、VEGF和MVD表達的相互關系

28例HIF-1a呈陽性表達的大腸腺癌組織MVD值為（53.22±10.15）；呈陰性表達的10例中MVD值為（42.75±10.47），呈正相關關系（rs=0.392，P<0.05）。VEGF呈陽性表達的25例大腸腺癌組織MVD值為（54.54±9.60）；呈陰性表達的10例中MVD值為（42.63±9.80），呈正相關關系（rs=0.491，P<0.05）。見表6。

3討論

本實驗發現HIF-1a在大腸腺癌組織中表達水平為73.7%（28/38）明顯高于大腸腺瘤組織45.5%（10/22）、正常大腸組織13.8%（4/29），差異有統計學意義（P<0.05），尤其是在腫瘤壞死明顯的區域和腫瘤浸潤邊緣。這提示HIF-1a的高表達與大腸腺癌的發生有相關性，這與國內外大多數相關報道基本一致。其表達水平增高可能是因為腫瘤組織氧濃度降低，也可能是抑癌基因突變或癌基因激活，從而導致一系列基因的表達水平增高，使腫瘤細胞耐受缺氧，促進腫瘤生長、浸潤、轉移。另外HIF-1a表達與淋巴結轉移有關，有淋巴結轉移的大腸腺癌HIF-1a的陽性表達率為93.8%（15/16）高于無淋巴結轉移組59.1%（13/22）；在腫瘤腸壁浸潤達漿膜或漿膜外組HIF-1a的陽性表達率為86.2%（25/27）高于腸壁浸潤未達漿膜層組的45.5%（5/11）；在大腸腺癌Ⅰ～Ⅱ和Ⅲ～Ⅳ病例中，HIF-1a的陽性表達率分別是59.1%（13/22）、93.8%（15/16），差異均有統計學意義（P<0.05）。提示HIF-1a表達異常與腺癌的淋巴結形成、腸壁浸潤深度及臨床分期有關，而且腫瘤腸壁浸潤越深、TNM分期越晚陽性表達率越高；HIF-1a的表達與患者性別、年齡、病理學分級、腫瘤部位、腫瘤大小無關（P>0.05）。Schindl等對206例淋巴結轉移陽性的乳腺癌標本的HIF-1a表達進行免疫組化分析，顯示HIF-1a陽性表達率為76.2%（157/206），也提示HIF-1a是高度侵襲性疾病的一個生物標志。本研究提示腫瘤細胞通過增強HIF-1a表達，促進腫瘤的生長和浸潤轉移。其可能的機制為HIF-1a調節VEGF的表達，VEGF進而作用于存在于血管內皮細胞表面的兩種受體VEGFR1和VEGFR2，從而激活了一系列的缺血轉導通路，誘導新生血管的生成，增高毛細血管通透性，來促進腫瘤的生長和浸潤轉移。

本研究發現在38例大腸腺癌組織中VEGF的陽性表達率為65.8%（25/38）明顯高于腺瘤組織31.8%（7/22）和正常大腸組織10.3%（3/29），差異有統計學意義（P<0.05），提示VEGF高表達可能與大腸腺癌的發生有一定相關性。這與國內外相關報道基本一致。本實驗還分析了VEGF表達與大腸腺癌臨床病理學及其相關因素的關系，在大腸腺癌組織中VEGF的表達與患者性別、年齡、腸壁浸潤深度、腫瘤部位、腫瘤大小無關（P>0.05）。與大腸腺癌的淋巴結形成、病理學分級及臨床分期有關，在無淋巴結轉移組和有淋巴結轉移組中，VEGF的陽性表達率分別是50.0%（11/22）、87.5%（14/16）；在病理分級高分化、中分化及低分化組中VEGF的陽性表達率分別是20.0%（1/5）、68.0%（17/25）、87.5%（7/8）；在Ⅰ～Ⅱ組和Ⅲ～Ⅳ組病例中，VEGF的陽性表達率分別是50.0%（11/22）、87.5%（14/16），差異均有統計學意義（P<0.05）。提示大腸腺癌組織中VEGF的表達明顯增高且與腫瘤的侵襲能力密切相關。VEGF是一種內皮細胞特異性有絲分裂原，能促進內皮細胞外基質溶解、內皮細胞遷移、增生和管腔形成，能直接刺激新生血管形成；VEGF還能增加血管尤其是微血管的通透性，為血管形成過程中多種細胞遷移提供一個纖維網絡，部分腫瘤細胞也可以穿過血管壁進入血管向遠處轉移，加速了腫瘤浸潤和轉移；VEGF亦可上調或誘導各種血管源因子和抗凋亡因子，促進腫瘤血管生成并提高腫瘤細胞的抗凋亡能力。

本實驗中，在38例大腸腺癌中，MVD值為52.36±9.66，在22例大腸腺瘤中MVD值為30.23±5.22，而29例大腸正常組織中MVD值為21.37±4.75，差異有統計學意義（P<0.05）。這與其他研究者對乳腺癌、肺癌、前列腺癌、子宮鱗癌等腫瘤組織MVD檢測的結果一致，這說明大腸腺癌組織的血管生成能力明顯增強。本實驗還分析了MVD值與大腸腺癌臨床病理學及其相關因素的關系，在大腸腺癌組織中MVD值與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小無關（P>0.05）；而在無淋巴結轉移組和有淋巴結轉移組中，MVD值分別是（44.97±10.00）、（58.02±7.75）；在腫瘤腸壁浸潤達漿膜或漿膜外組MVD值為55.09±9.24高于腸壁浸潤未達漿膜層組的（39.13±6.06）；在病理分級高分化、中分化及低分化組中MVD值分別是（43.12±13.19）、（49.20±8.90）、（59.00±12.47）；在Ⅰ～Ⅱ組和Ⅲ～Ⅳ組病例中，MVD值分別是（44.97±10.00）、（58.02±7.75），差異均有統計學意義（P<0.05）。MVD值與大腸腺癌的淋巴結形成、腸壁浸潤深度、病理學分級及臨床分期有關，可能因為腫瘤的快速生長，使其處于相對缺氧的狀態，促使了大腸腺癌血管新生，維持了腫瘤生長，同時新生的腫瘤血管又加速了腫瘤的浸潤和轉移。因此說明血管生成在大腸腺癌的發生、發展過程中起到重要作用。

研究已證實VEGF是刺激腫瘤血管形成最關鍵的生長因子，其表達受許多外部因子調控，HIF-1a為其中之一，有研究表明HIF-1a可上調多種血管生成因子的表達來介導缺氧狀態下的血管形成反應，可介導VEGF和其他缺氧反應基因的轉錄活性。大量的研究證明HIF-1與VEGF存在正相關關系，Bos等研究表明在乳腺癌的形成中，HIF-1a的表達與血管內皮細胞生長因子VEGF的表達、腫瘤細胞的高增殖狀態呈正相關，認為HIF-1a可作為乳腺癌患者新的預后指標之一。本實驗與國內外的研究相一致。

本實驗研究發現HIF-1a、VEGF均與MVD值存在正相關關系。提示兩種因子均可通過各種的信號傳導通路促進大腸腺癌血管的生成，并與大腸腺癌的發生、發展與侵襲轉移密切相關。因此深入研究HIF-1a可能將為大腸腺癌的放化療及基因治療提供新的靶點。