木犀草素聯合替莫唑胺對腦膠質瘤大鼠VEGF表達的影響

陳俠+唐省三+賴滿香+來慧麗+溫李滔

[摘要]目的研究木犀草素聯合替莫唑胺對腦膠質瘤大鼠VEGF表達的影響。方法建立大鼠U87-MG腦膠質瘤模型，以隨機數字表法分為四組，每組20只。接種14d后給予替莫唑胺組替莫唑胺25mg/（kg·d），木犀草素組木犀草素20mg/（kg·d），聯合組給予木犀草素20mg/（kg·d）、替莫唑胺25mg/（kg·d），均配置為2mL生理鹽水溶液后腹部注射，空白組每天給予等量生理鹽水。給藥5周后將腦膠質瘤細胞切片染色，免疫組化法檢測各組大鼠腦膠質瘤細胞中VEGF水平。結果聯合組VEGF陽性與強陽性表達數量之和所占比例為20%，與空白組、木犀草素組、替莫唑胺組85%（x²=16.942）、70%（x²=10.101）、55%（x²=5.227）相比均明顯下降（P<0.05）。結論木犀草素聯合替莫唑胺治療U87-MG腦膠質瘤，可有效抑制腫瘤VEGF表達，對腦膠質瘤的化療效果起增敏作用。

[關鍵詞]木犀草素；替莫唑胺；腦膠質瘤；VEGF

腦膠質瘤為神經系統中最常見的原發性腫瘤，惡性居多且極具浸潤性、侵襲性，治療困難且易復發，大多數患者預后不良。臨床普遍采用手術切除聯合放療、化療等手段的綜合治療策略。盡管目前對腦膠質瘤的治療已取得長足進步，但治療仍缺乏突破性進展。有研究顯示腫瘤血管內皮因子（VEGF）在腫瘤生長中起重要作用，因此VEGF的表達抑制也成為腫瘤治療的重要方向。近年來。替莫唑胺作為一種新型化療藥物已于膠質瘤的治療中廣泛應用，可明顯延長惡性膠質瘤患者進展存活時間。但該藥仍存在較重的化療毒副反應，且難以通過血腦屏障，治療效果不夠理想。為探究新型化療方案以提升替莫唑胺的化療效果，本研究建立大鼠腦膠質瘤模型，并應用木犀草素、替莫唑胺聯合治療，觀察VEGF表達變化，現報道如下。

1材料與方法

1.1實驗動物

實驗所用wistar成年雄性大鼠均由中國醫科大學動物實驗中心提供，符合臨床實驗標準，月齡18月，體重200～230g，發育健康。

1.2細胞株

本研究采用大鼠U87-MG膠質瘤細胞株，購于中國科學院上海細胞生物學研究所。

1.3儀器與試劑

CO₂細胞培養箱（HERAcell 2401）由美國賽默飛公司提供，SW-CJ超凈臺購于蘇州零三凈化設備有限公司。DMEM培養基、胎牛血清（FBS）均從Gibco公司購置，離心機由美國Sigma公司提供，木犀草素由Sigma-aldrich提供，替莫唑胺為江蘇天士力帝益藥業有限公司生產（H20040635）。

1.4實驗方法

1.4.1細胞處理與懸液制備在含有10%FBS的DMEM高塘培養基中培養U87-MG細胞，在細胞生長處于對數期時加入不含FBS的DMEM培養基制成細胞懸液，保持每10μL含1x10⁶個C6細胞。將懸液離心，取下層細胞備用。

1.4.2大鼠接種接種前需將大鼠以10%的水合氯醛麻醉處理，固定其頭部于腦立體定位儀并分離顯露顱骨，以大鼠右側腦尾狀核為注射靶點，保持1μL/min的速度注射10μL C6細胞懸液。矢狀縫右側3cm，深5cm。注射完全后以生理鹽水沖洗，縫合切口。接種14d后可開展給藥實驗。

1.4.3分組及用藥方法按照隨機數字法將80只大鼠分為四組，每組20只。替莫唑胺組每天給予替莫唑胺25mg/kg，木犀草素組每天給予20mg/kg，聯合組每天給予木犀草素20mg/kg、替莫唑胺ZSmg/kg。均以生理鹽水配置為2mL溶液，空白組不給予藥物，每天注射生理鹽水100mL/kg，經腹腔注射，連續給藥兩周。

1.4.4檢測方法5周后將所有小鼠以過量麻醉劑處死，多聚甲醛灌注至動脈血管，并觀察大鼠腦部膠質瘤生長狀況。采用免疫組化實驗分別測定四組VEGF表達水平，將膠質瘤組織冠狀切面后DAB染色測定，嚴格遵循試劑盒操作說明。經圖像分析處理以后灰度計算目標視野中陽性染色的單位面積。陽性細胞標準為細胞質內有橙黃色顆粒，綜合染色強度與陽性細胞比例確定陰性（一）、弱陽性（+）、陽性（++）和強陽性（+++）數量。

1.5統計學方法

本研究數據均采用SPSS17.0軟件處理分析，計數資料的組問比較行X²檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1四組VEGF表達結果比較

聯合組陽性與強陽性數量之和所占比例為20%，與空白組、木犀草素組、替莫唑胺組85%（x²=16.942，P<0.05）、70%（x²=10.101，P<0.05）、55%（x²=5.227，P<0.05）相比均明顯下降，見表1。

2.2VEGF染色圖像比較

四組大鼠于接種4周后出現不同程度的消瘦、反應遲緩的腦膠質瘤癥狀，至第5周時癥狀加重，并明顯消瘦。膠質瘤細胞染色圖像呈現不同VEGF表達水平。見圖1。

3討論

膠質瘤是一類發病率較高的惡性實體腫瘤，腫瘤伴隨豐富的新生血管，具有浸潤性與高復發率。臨床研究已經證實，新生血管與腫瘤浸潤、轉移、預后均有密切關系，膠質瘤的惡性級別越高，血管密度越高。在膠質瘤的實際診療中，腫瘤血管密度是一項重要指標，也是眾多藥物的治療方向。有眾多數據顯示，VEGF是血管內皮細胞特異性生長及血管通透性的重要調控因子，通常可在腦膠質瘤患者體內檢測到VEGF的高表達，并由此引起腫瘤微血管密度增加。因此，VEGF的表達可作為膠質瘤惡性程度的有效指標，其表達水平越高，證明病情越嚴重。

隨著對腦膠質瘤化療藥物的研究越發深入，卡莫司汀、洛莫司汀、替莫唑胺等藥物的臨床使用也越來越廣泛，其中又以替莫唑胺的應用最多。但近年來研究顯示，替莫唑胺存在難以通過血腦屏障、毒副反應重的缺點，加上耐藥性難以克服，都導致化療效果仍不甚理想。因此，新型化療方案的提出勢在必行。木犀草素代表性的天然黃酮類化合物，可從多種植物中提取，具有多種顯著生物活性。近年來有大量的研究發現木犀草素對結腸癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌等癌癥有顯著療效，但目前還未有木犀草素應用于腦膠質瘤的相關報道。本研究嘗試將木犀草素與替莫唑胺聯合使用于腦膠質瘤建模的大鼠，觀察腦膠質瘤細胞中VEGF的表達水平，旨在探究其對化療效果的影響。

國內研究者發現，木犀草素對胃癌BGC-823細胞的生長有顯著的抑制作用，并明顯降低腫瘤VEGF的表達水平；另一項關于的乳腺癌的研究則表明木犀草素可通過抑制IL-8對內皮細胞的ERK、AKT信號激活作用，進而抑制血管生成并誘導胰腺癌細胞凋亡。本研究結果也顯示，以木犀草素聯合替莫唑胺對腦膠質瘤大鼠化療治療，腫瘤細胞VEGF陽性與強陽性表達數量明顯下降，該百分比與空白組、單藥治療組相比均有明顯差異，表明木犀草素可提高膠質瘤對化療藥物的敏感性，增強藥物誘導腫瘤細胞凋亡的能力。已有資料顯示，在化療過程中，VEGF的表達也會有所上升并促進新生血管的生成，進而導致腫瘤復發，這也是影響腫瘤治療效果的中的重要障礙。但另有研究顯示，木犀草素可通過抑制COX-2的合成來減少化療導致的VEGF分泌量，由此抑制腫瘤血管的新生并達到化療增敏效果，也從側面證實了本文結果。此外，木犀草素還可通過腫瘤血腦屏障，可更直接的完成腫瘤細胞清除，這也是其較傳統藥物最顯著的優勢，因此十分適用于腦膠質瘤的治療中。

綜上，本研究證明木犀草素可顯著提升替莫唑胺對腦膠質瘤的化療效果，有效降低聯合組VEGF表達水平，提示木犀草素在腦膠質瘤治療中的良好應用前景。但木犀草素對替莫唑胺化療的增敏機制尚為研究透徹，需進一步深入研究證實。