楊桃根總提取物對(duì)糖尿病小鼠腎功能及其抗氧化應(yīng)激作用的研究

徐小惠，范氏泰和，韋曉潔，覃 妮，黃仁彬

(廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021)

楊桃根總提取物對(duì)糖尿病小鼠腎功能及其抗氧化應(yīng)激作用的研究

徐小惠，范氏泰和，韋曉潔，覃 妮，黃仁彬

(廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021)

目的 探討楊桃根總提取物(EACR)對(duì)糖尿病小鼠腎損傷及其抗氧化應(yīng)激的作用。方法 小鼠尾靜脈注射120 mg·g-1鏈脲佐菌素(STZ)建立糖尿病模型小鼠，隨機(jī)分為5組：模型對(duì)照組、纈沙坦組(20 mg·kg-1)、EACR低、中、高劑量組(300、600、1 200 mg·kg-1)，再設(shè)正常對(duì)照組，每組10只小鼠。分別于藥前、藥后測(cè)各組小鼠空腹血糖(FBG)。末次給藥后，收集血清和尿液，檢測(cè)小鼠血清中肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)的含量以及24 h尿量及尿蛋白水平；試劑盒檢測(cè)小鼠腎臟組織中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)的活性和丙二醛(MDA)含量；HE染色觀(guān)察腎臟組織的病理學(xué)變化；ELISA法檢測(cè)腎組織中氧化氫酶(CAT)、活性氧簇(ROS)的含量；蛋白免疫印跡法檢測(cè)腎組織中Cyto-C、AIF、caspase-3的蛋白表達(dá)。結(jié)果 與模型組比較，纈沙坦組以及EACR中、高劑量組的血清生化指標(biāo)和24 h尿蛋白水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。糖尿病小鼠給藥后，EACR能明顯降低MDA含量，提高SOD、GSH-Px、CAT活性；下調(diào)ROS、Cyto-C、AIF、caspase-3的表達(dá)(P<0.05)。HE結(jié)果顯示EACR還能改善糖尿病小鼠腎小球病理變化。結(jié)論 楊桃根總提取物可減輕糖尿病小鼠血清中Cr和BUN的水平，降低腎臟組織中MDA、ROS含量，以及提高組織中抗氧化因子SOD、GSH-Px活性及CAT的含量，下調(diào)腎組織中Cyto-C、AIF、caspase-3的蛋白表達(dá)，緩解氧化應(yīng)激對(duì)腎組織所造成的損傷，從而起到改善糖尿病小鼠腎損傷的作用。

楊桃根總提取物；糖尿病；腎損傷；氧化應(yīng)激；ROS；促凋亡因子

糖尿病是一種由多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂疾病，與此同時(shí)還被廣泛認(rèn)為是一種慢性炎癥性疾病。在長(zhǎng)期高血糖的環(huán)境下會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，大量的ROS產(chǎn)生可激活引起糖尿病腎病晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)途徑[1]。由于糖尿病患者代謝紊亂影響了清除自由基的各種抗氧化酶的活性和表達(dá)，引起自由基增多，進(jìn)而損傷腎臟組織[2]。所以降低或改善糖尿病患者的氧化應(yīng)激狀態(tài)，能有效緩解糖尿病患者病程進(jìn)展，對(duì)其并發(fā)癥的防治也起到很大的作用。

楊桃根(AverrhoacarambolaL. root, ACLR)為酢漿草科屬植物的新鮮或干燥根，其藥理作用廣泛，民間多用于改善消化功能、治療咳嗽以及糖尿病[3-4]。在我們的前期研究中已發(fā)現(xiàn)，楊桃根醇提物對(duì)糖尿病小鼠具有降血糖作用，楊桃根多糖有明顯的體外抗氧化作用[5-6]。此外，楊桃根總提取物還可以降低糖尿病小鼠血清中游離脂肪酸(FFAs)水平，改善胰島細(xì)胞凋亡[7]。故本研究將探討楊桃根總提取物基于腎臟組織的氧化應(yīng)激功能，對(duì)糖尿病小鼠血糖和腎臟損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑 SPF級(jí)♂ KM小鼠，體質(zhì)量(20±2) g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)良好，室溫18 ℃～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，12 h光照晝夜循環(huán)。試驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SCXK(桂)2009-0002。纈沙坦片(北京京豐制藥有限公司，批號(hào)：151019)；鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ美國(guó)Sigma公司)；考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)20150927)；SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)20150925)；丙二醛(MDA)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)20150925)；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)20150918)；ROS試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào) 20151017)；氧化氫酶(CAT)試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào) 20151009)；預(yù)染蛋白Marker(西安潤(rùn)德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)QE15104)；Cyto-C、AIF、caspase-3蛋白抗體(武漢博士德有限公司，批號(hào)2691107)；HRP 標(biāo)記的兔抗羊IgG抗體(Santa Cruz Biotechnology，批號(hào)CV20151028)；多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology，批號(hào)SC-1507)。

1.2 儀器 羅氏卓越型血糖儀(ACCU-CHEK Performa，注冊(cè)證號(hào)：國(guó)食藥監(jiān)械(進(jìn))字2008第2403661號(hào))；卓越金銳血糖試紙(注冊(cè)證號(hào)：國(guó)食藥監(jiān)械(進(jìn))字2010第2400386號(hào))；垂直電泳儀(BIO-RAD公司)；轉(zhuǎn)膜及顯影設(shè)備(BIO-RAD公司)；全自動(dòng)生化分析儀(日立公司，7100)

1.3 糖尿病模型建立及分組給藥 取90只♂昆明小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量(20±2)g，造模前禁食12 h，隨機(jī)選取10只作為正常對(duì)照組，其余小鼠分別尾靜脈注射STZ(120 mg·kg-1)。72 h后尾巴取血測(cè)FBG，選取FBG 11.1 mmol·L-1以上的小鼠作為造模成功的糖尿病小鼠。將造模成功的小鼠隨機(jī)分配成5個(gè)組，每組10只，分別為模型對(duì)照組，纈沙坦對(duì)照組(20 mg·kg-1)，EACR低、中、高劑量組(300、600、1 200 mg·kg-1)。成模后纈沙坦組對(duì)照組、EACR各給藥組每天上午空腹灌胃給藥1次，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組組灌胃生理鹽水，各組連續(xù)給藥42 d。

1.4 標(biāo)本采集 采用代謝鼠籠收集小鼠24 h尿；小鼠尾巴取血檢測(cè)藥前、藥后的FBG；末次給藥后小鼠拔眼球取血，以3500 r·min-1離心10 min，取血清待測(cè)。取小鼠腎臟組織用4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，進(jìn)行HE染色。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 FBG測(cè)定 小鼠尾靜脈取血，用血糖儀和試紙測(cè)定。

1.5.2 血清Cr 、BUN和24 h尿蛋白檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.5.3 腎臟組織SOD、GSH-Px活性和MDA、CAT、ROS水平測(cè)定 小鼠取材時(shí)摘取新鮮腎臟組織，取部分組織用生理鹽水制成10%勻漿，取上清液試劑盒法測(cè)定SOD、MDA和GSH-Px；ELISA法檢測(cè)CAT、ROS的含量。

1.5.4 蛋白免疫印跡法檢測(cè) 檢測(cè)腎皮質(zhì)中Cyto-C、AIF、caspase-3的蛋白表達(dá)。

1.5.5 腎臟組織的病理學(xué)檢測(cè) 常規(guī)石蠟包埋，進(jìn)行HE染色。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般狀態(tài)的觀(guān)察 與正常對(duì)照組相比，小鼠尾靜脈注射120 mg·kg-1STZ的72 h內(nèi)，逐漸出現(xiàn)多飲、多尿、毛發(fā)松散、精神較萎靡；42 d后，模型組小鼠體質(zhì)量較正常組小鼠有所下降，其一般狀態(tài)未有明顯改善。與模型組比較，纈沙坦組和楊桃根各給藥組的小鼠一般狀態(tài)均有所改善。

2.2 EACR對(duì)糖尿病小鼠FBG的影響 由Tab 1可知，與正常組比較，模型組FBG明顯升高(P<0.01)。與模型組比較， EACR中、高劑量組的FBG均有所下降，其中EACR各劑量組的FBG下降呈劑量依賴(lài)性。

GroupDose/g·kg-1FBG/mmol·L-1Pre?treatment42dposttreatmentNormalcontrol6．45±2．137．41±1．48Modelcontrol20．35±2．74?28．27±2．54?Valsartan0．0221．34±4．41?29．48±5．21?EACR0．320．58±6．21?27．19±4．02?0．619．54±6．22?21．64±4．00?Δ1．219．95±5．54?16．28±5．38?Δ

*P<0.05vsnormal control;ΔP<0.05vsmodel control

2.3 EACR對(duì)糖尿病小鼠血清Cr 、BUN和24 h尿量及尿蛋白的影響 由結(jié)果可知，與正常組比較，模型組小鼠的BUN、Cr和尿蛋白值明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，纈沙坦組以及EACR中、高劑量組腎功能指標(biāo)的水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)Tab 2。

GroupDose/g·kg-1BUN/mg·dL-1Cr/mg·dL-124hurinevolume/mLUrinaryprotein/mg·d-1Normalcontrol-17．21±1．70．42±0．0640．68±0．032．63±0．18Modelcontrol-27．13±2．3?0．56±0．063?2．74±0．37?6．97±0．47?Valsartan0．0220．11±2．6?Δ0．45±0．040Δ1．41±0．19?Δ4．83±0．33?ΔEACR0．327．59±2．3?0．51±0．058?2．53±0．52?5．68±0．23?Δ0．625．95±3．4?0．47±0．075?Δ2．29±0．35?Δ5．71±0．42?1．224．00±3．7?Δ0．47±0．051?Δ1．87±0．21?Δ4．10±0．26?Δ

*P<0.05vsnormal control;ΔP<0.05vsmodel control

GroupDose/g·kg-1SOD/kU·g-1MDA/mmol·g-1GSH?Px/kU·g-1Normalcontrol-316．02±24．406．84±1．19672．36±119．26Modelcontrol-196．38±13．27?15．77±3．18?486．24±100．28?Valsartan0．02276．05±33．05?Δ8．46±3．36Δ625．10±140．30?ΔEACR0．3206．24±30．24?16．04±4．14?509．11±79．54?0．6216．86±21．54?14．13±2．37?549．24±164．32?Δ1．2245．01±18．97?Δ10．24±2．21?Δ61005±128．06?Δ

*P<0.05vsnormal control;ΔP<0.05vsmodel control

GroupDose/g·kg-1CAT/MU·g-1ProROS/kU·L-1Normalcontrol-11．38±1．57209．08±31．73Modelcontrol-6．51±1．34?396．27±34．51?Valsartan0．0213．59±3．06?Δ251．13±33．98?ΔEACR0．37．14±1．88?Δ391．25±21．71?Δ0．610．52±1．65Δ337．67±35．26?Δ1．212．63±2．41?Δ286．45±29．68?Δ

*P<0.05vsnormal control;ΔP<0.05vsmodel control

GroupDose/g·kg-1Cyto?CAIFcaspase?3Normalcontrol-0．07±0．020．27±0．070．12±0．05Modelcontrol-0．46±0．07?0．62±0．12?0．85±0．17?Valsartan0．020．18±0。05?Δ0．43±0．11?Δ0．38±0．08?ΔEACR0．300．41±0．13?0．59±0．08?0．76±0．13?Δ0．600．35±0．09?Δ0．55±0．07?Δ0．62±0．12?Δ1．200．22±0．06?Δ0．46±0．13?Δ0．45±0．09?Δ

*P<0.05vsnormal control;ΔP<0.05vsmodel control

2.4 EACR對(duì)糖尿病小鼠腎臟組織中SOD、GSH-Px活性和MDA水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠腎臟組織中SOD和GSH-Px活性明顯下降，MDA含量升高(P<0.05)。與模型組比較，纈沙坦組以及EACR中、高劑量組的SOD和GSH-Px活性升高，MDA水平明顯降低，但EACR低劑量組無(wú)明顯改變。見(jiàn)Tab 3。

2.5 EACR對(duì)糖尿病小鼠腎臟組織中CAT、ROS的影響 與正常組比較，模型組小鼠腎臟組織ROS的含量明顯上升，CAT的含量明顯下降(P<0.05)。與模型組比較，EACR中、高劑量組ROS的含量明顯降低，CAT的含量明顯升高。見(jiàn)Tab 4。

2.6 EACR對(duì)糖尿病小鼠腎臟組織中Cyto-C、AIF、caspase-3表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組小鼠腎臟組織中Cyto-C、AIF、caspase-3的蛋白表達(dá)明顯上升(P<0.05)。與模型組比較，纈沙坦組、EACR中、高劑量組Cyto-C、AIF、caspase-3的蛋白表達(dá)明顯降低。見(jiàn)Tab 5、Fig 1。

Fig 1 Effects of EACR on expressions of Cyto-C,AIF and caspase-3 in kidney tissues of diabetic mice

A: Normal control group; B: Model control group; C: Valsartan control group; D: Low dose of EACR group; E: Moderate dose of EACR group; F: High dose of EACR group

2.7 EACR對(duì)糖尿病小鼠腎臟組織病理學(xué)變化的影響 腎臟組織HE染色可見(jiàn)，正常對(duì)照組小鼠腎臟組織中細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密、完整，腎小球結(jié)構(gòu)飽滿(mǎn)。模型對(duì)照組中腎小球萎縮，腎小管空泡變性；給藥組小鼠的腎臟組織形態(tài)較模型組有一定的改善。見(jiàn)Fig 2。

Fig 2 Histological observations of kidney tissues (HE staining×400)

A: Normal control group; B: Model control group; C: Valsartan control group; D: Low dose of EACR group; E: Moderate dose of EACR group; F: High dose of EACR group

3 討論

糖尿病腎病(DN)為糖尿病患者常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥，患者出現(xiàn)嚴(yán)重的代謝紊亂，發(fā)展到末期腎病會(huì)嚴(yán)重影響其生存質(zhì)量。DN發(fā)病機(jī)制與晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)累積、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激作用等途徑有關(guān)[8]。

在正常的生理狀態(tài)下，一定濃度的ROS是維持細(xì)胞正常生命活動(dòng)所必需的物質(zhì)，參與正常的細(xì)胞增殖、凋亡以及Ca2+儲(chǔ)存等生理過(guò)程的調(diào)節(jié)。但是機(jī)體在病理狀態(tài)下，機(jī)體的ROS濃度升高，可造成機(jī)體中蛋白質(zhì)、DNA和脂質(zhì)過(guò)氧化損傷[9]。在高糖狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)NADH /NAD+比率增加，由NADH或FADH2通過(guò)呼吸鏈電子傳遞體傳遞的電子漏出增多，ROS產(chǎn)生增加[10]。同時(shí)高血糖還可導(dǎo)致抗氧化酶活性表達(dá)下降，清除氧自由基能力下降，進(jìn)一步導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)ROS的增多及積聚，導(dǎo)致惡性循環(huán)，進(jìn)而引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。

研究表明[11]，高糖所致線(xiàn)粒體內(nèi)ROS增多可引起線(xiàn)粒體內(nèi)膜脂質(zhì)和蛋白損傷，誘導(dǎo)內(nèi)膜流動(dòng)性和通透性改變，通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)開(kāi)啟，破壞線(xiàn)粒體膜電位并使線(xiàn)粒體內(nèi)滲透壓改變，使線(xiàn)粒體發(fā)生腫脹，ATP 合成下降[12]；促使線(xiàn)粒體基質(zhì)內(nèi)促凋亡因子CytoC、DIABLO和AIF等外流，在胞質(zhì)內(nèi)激活caspase依賴(lài)和非依賴(lài)性凋亡途徑[13]，最終導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡、系膜細(xì)胞外基質(zhì)堆積及腎小球基底膜增厚[14]。

臨床上DN主要的治療方案是通過(guò)控制血糖的升高，調(diào)節(jié)血脂代謝以及替代治療，要根據(jù)病程、病期及患者的自身特點(diǎn)制定個(gè)體優(yōu)化方案。中藥在防止DN的方針中主要以延緩DN的發(fā)生發(fā)展和改善其腎臟功能為出發(fā)點(diǎn)[15]。我們近期研究發(fā)現(xiàn)，楊桃根總提取物(EACR)不僅能降低糖尿病小鼠血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和FFAs的含量，還可調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而改善糖尿病小鼠的代謝功能和抑制胰腺組織凋亡。故現(xiàn)深入研究，EACR對(duì)糖尿病小鼠STZ所致的腎損傷是否有保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EACR能明顯降低糖尿病小鼠血清中Cr、BUN和尿液中尿蛋白的水平，升高腎臟組織中抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性，以及降低組織中ROS、MDA含量，下調(diào)腎組織中Cyto-C、AIF、caspase-3的蛋白表達(dá)，并改善腎臟組織的病理學(xué)變化。提示楊桃根總提取物其作用機(jī)制可能為降低ROS的含量及提高抗氧化因子的活性，下調(diào)促凋亡因子Cyto-C、AIF、caspase-3的蛋白表達(dá)，緩解高糖所致的氧化應(yīng)激對(duì)腎臟組織所造成的損傷，從而起到腎臟的保護(hù)作用。

(致謝：本文實(shí)驗(yàn)在廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室完成，黃仁彬教授設(shè)計(jì)并指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)研究，在范氏泰和，韋曉潔和覃妮的協(xié)助下完成實(shí)驗(yàn)。)

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Study of the extract of averrhoacarambola L. root on renal function in diabetic mice and its anti-oxidative action

XU Xiao-hui, Hoa Thi Thai Phama, WEI Xiao-jie, QIN Ni, HUANG Ren-bin

(PharmaceuticalCollege,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Aim To investigate the effect of the extract ofAverrhoacarambolaL. root (EACR) on renal function in diabetic mice and its anti-oxidative action. Methods Diabetic mice were established by tail vein injection with 120 mg·kg-1streptozotocin (STZ) and were divided into 5 groups: model control group, valsartan control group, and low-, middle-, high-dose of EACR groups (300, 600, 1 200 mg·kg-1). And 10 normal mice consisted of normal control group. The fasting blood glucose (FBG) of mice was detected before and after administration of drugs. After last administration, the blood and urine samples were collected for creatinine (Cr), urea nitrogen (BUN), urine and 24 h urinary protein determination. The activities of superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px) and malonaldehyde (MDA) content were determined using kits. HE staining was conducted to observe the pathological changes of kidney tissues. ELISA method was utilized to detect the contents of catalase (CAT) and reactive oxygen species (ROS). The expressions of Cyto-C, AIF and caspase-3 proteins in kidney tissues were analyzed by Western blot. Results Compared with model group, the serum biochemical indexes and 24 h urinary protein of valsartan and moderate-, high-dose of EACR groups were decreased with statistical significance (P<0.05). After the treatment, the MDA content was decreased by EACR treatment, and SOD, GSH-Px and CAT activities were enhanced. Meanwhile the expressions of ROS,Cyto-C, AIF and caspase-3 were down-regulated. The pathological changes of kidney tissues were ameliorated by EACR through HE results. Conclusions The extract ofAverrhoacarambolaL. root can decrease the serum levels of Cr and BUN, reduce the MDA and ROS contents in kidney tissue and enhance the activities of SOD, GSH-Px and CAT, down-regulate the expressions of Cyto-C, AIF and caspase-3 proteins in kidney tissues, elevate the anti-oxidative effect of kidney. Therefore, the renal function of diabetic mice is meliorated.

extract ofAverrhoacarambolaL. root; diabetes; renal injury; oxidative stress; ROS; apoptogenic factor

時(shí)間：2016-12-27 16:13

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161227.1613.034.html

2016-06-30,

2016-10-20

廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃資助項(xiàng)目(No YCBZ2015035)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81360129, 81460205)；南寧市青秀區(qū)科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃(No 2013S12)

徐小惠(1991-)，女，博士生，研究方向：糖尿病藥理學(xué)，E-mail：1056112307@qq.com； 黃仁彬(1955-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：糖尿病藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：huangrenbin518@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.01.017

A

1001-1978(2017)01-1705-05

R-332；R284.1；R322.61；R587.1；R692