MiR-214對人乳腺癌MCF-7細胞生物學行為的影響*

田延鋒，李 芳，劉 擘，趙增仁，代擁軍，魏 明

河北醫科大學第一醫院普外科 石家莊 050031

MiR-214對人乳腺癌MCF-7細胞生物學行為的影響*

田延鋒△，李 芳，劉 擘，趙增仁，代擁軍，魏 明

河北醫科大學第一醫院普外科 石家莊 050031

△男，1969年4月生，碩士，教授，主任醫師，研究方向：乳腺癌的基礎與臨床，E-mail:tianyanfeng1212@163.com

乳腺癌；微小RNA；MCF-7細胞；細胞增殖

目的：探討微小RNA-214(miR-214)對人乳腺癌MCF-7細胞增殖、凋亡、遷移及周期分布等生物學行為的影響。方法：采用脂質體轉染法將miR-214 模擬物轉入MCF-7 細胞(實驗組)，以轉入miR-214陰性對照的MCF-7 細胞(陰性對照組)作對照。采用實時熒光定量PCR 法檢測miR-214的表達情況；CCK-8法檢測細胞增殖能力的改變；流式細胞儀檢測細胞凋亡及細胞周期；劃痕愈合實驗檢測細胞的遷移。結果：實驗組MCF-7細胞miR-214的表達較陰性對照組明顯上調； 實驗組細胞的增殖能力明顯受到抑制；實驗組凋亡細胞所占比例明顯高于陰性對照組(P=0.008)，G1期細胞數增加，S 期細胞數減少(P<0.05)；劃痕愈合實驗表明，實驗組細胞遷移能力明顯受到抑制(P<0.001)。結論：MiR-214可能通過抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖及遷移、促進細胞凋亡及影響細胞周期的分布而發揮抑癌作用。

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤[1]。微小RNAs (miRNAs/miRs)是一個保守的小分子非編碼RNA家族，長度約22個核苷酸，它們通過堿基配對的方式與靶基因的3’非翻譯區 (UTR)互補結合而在轉錄后水平調控基因的表達，從而導致靶基因mRNA的降解或抑制其翻譯[2-3]。有研究[4]表明，miRNAs可以調控人體約1/3基因的表達。miR-214可通過多種信號轉導途徑發揮抑癌或促癌的作用，并且與多種惡性腫瘤的發生發展及預后密切相關。目前，miR-214 在乳腺癌中的功能尚不清楚[5]。該研究擬采用脂質體轉染的方法在乳腺癌細胞中過表達miR-214，觀察miR-214過表達對乳腺癌MCF-7細胞增殖、凋亡、周期分布及遷移的影響，為乳腺癌的診斷及治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑 人乳腺癌細胞株MCF-7為河北醫科大學第一醫院中心實驗室保存。RPMI 1640 培養液、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Gibco公司；CCK-8 試劑購自同仁化學研究所；碘化丙啶購自索萊寶公司；青鏈霉素、Trizol 試劑和LipofectamineTM2000細胞轉染試劑購自美國Invitrogen公司；miR-214 陰性對照及模擬物購于廣州銳博生物科技有限公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自深圳欣博盛生物科技有限公司；反轉錄試劑盒、Taqman Universal Master Mix 及相關引物均購自美國ABI公司。

1.2 細胞培養 乳腺癌MCF-7細胞用含體積分數10%胎牛血清及青鏈霉素的RPMI 1640 培養液于37 ℃、體積分數5%CO2的細胞培養箱中培養。根據細胞生長狀況每2～3 d更換新鮮培養液1次。當細胞融合70%～80%時, 用胰蛋白酶消化并進行細胞傳代或收集細胞。

1.3 細胞鋪板及轉染 收集細胞后，重懸混勻，調整細胞濃度至1×105mL-1，鋪6孔板，2 mL/孔，混勻后入溫箱中繼續培養。培養24 h后嚴格按照LipofectamineTM2000說明書進行細胞轉染，實驗分為實驗組(轉染miR-214模擬物)及陰性對照組(轉染miR-214陰性對照)，每組設3個復孔。轉染后6 h，更換無血清培養液為新鮮完全培養液，繼續培養并進行后續實驗。

1.4 實時熒光定量PCR檢測轉染后細胞miR-214的表達 轉染48 h后，收集細胞，按照Trizol說明書提取的總RNA，應用實時熒光定量PCR(Taqman探針法)檢測miR-214，嚴格按檢測試劑盒說明書進行操作。按照TaqMan反轉錄試劑盒說明書合成cDNA。以cDNA為模板，按照試劑盒說明書提供的方法在Real-time PCR AB7500儀上進行PCR 擴增，以U6 為內參照。20 μL反應體系：TaqMan Universal Master Mix 10 μL，20×TaqMan Assay 1 μL,cDNA模板2 μL,RNase-free water 7 μL。反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，1個循環；然后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環。根據待測標本的Ct值，采用2-ΔCt法計算miR-214的相對表達量，其中ΔCt=目的基因Ct值-內參基因Ct值。

1.5 CCK-8法檢測MCF-7細胞的增殖能力 轉染48 h后，收集細胞，以新鮮的RPMI 1640培養液重懸細胞并調整濃度至1×104mL-1，鋪板，每組均設5個復孔，分別于0、1、2、3及4 d檢測細胞活性。檢測前1 h每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培養箱中培養1 h后用酶標儀測定450 nm處的吸光度(A450)值。以時間為橫坐標，A450值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.6 流式細胞儀檢測MCF-7細胞凋亡情況 收集轉染48 h后各組細胞，用預冷、4 ℃無菌的PBS液充分洗滌細胞2次。按照Annexin V-FITC試劑盒說明書進行溶液的配制，以250 μL結合緩沖液重新懸浮細胞，取195 μL的細胞懸液加入5 μL Annexin V-FITC,輕輕混勻，間隔3 min后再加入10 μL濃度為20 mg/L的碘化丙啶溶液，混勻后于室溫下避光孵育10 min，加300 μL結合緩沖液，輕輕混勻后上流式細胞儀進行檢測分析。

1.7 流式細胞儀檢測MCF-7細胞周期 收集轉染48 h后的細胞，4 ℃無菌PBS漂洗并離心2次，收集沉淀，加體積分數75%冰凍乙醇并振蕩，4 ℃固定過夜。次日離心，棄上清，PBS洗滌細胞1次，采用碘化丙啶法檢測細胞周期：加入200 μL含有50 mg/L碘化丙啶和100 mg/L RNA酶的PBS染色液，4 ℃避光靜置1 h，最后上流式細胞儀檢測。

1.8 劃痕愈合實驗 實驗分組如1.3，以4×105細胞/孔均勻鋪6孔板，待細胞培養至單層密度達80% ～ 90%時轉染，轉染方法同前。取轉染后24 h的細胞，用200 μL無菌槍頭在每孔底部畫一條直線，1×PBS洗3 次，然后加入含有體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基，37 ℃、體積分數5% CO2培養箱中培養。使用倒置相差顯微鏡分別在0 和48 h 時拍照。實驗重復3次。運用Image-Pro Plus軟件測算劃痕寬度。劃痕愈合率=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.9 統計學處理 采用SPSS 19.0分析。各組細胞中miR-214的表達、細胞凋亡、細胞周期及劃痕愈合實驗結果均采用兩獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各組MCF-7細胞miR-214的表達 實驗組miR-214表達水平為(669.00±638.80)，陰性對照組為(0.94±0.04)，實驗組miR-214的表達遠高于陰性對照組。

2.2 各組MCF-7細胞增殖情況 結果見圖1。 說明轉染miR-214模擬物能抑制MCF-7 細胞的增殖。

圖1 各組MCF-7細胞增殖情況

2.3 各組MCF-7細胞的凋亡情況 實驗組MCF-7凋亡細胞所占比例為(3.853±0.911)%，明顯高于陰性對照組的(1.243±0.173)%，差異有統計學意義(t=4.887,P=0.008)。

2.4 各組MCF-7細胞周期的情況 結果見表1，實驗組G1期細胞所占比例明顯增多，S期細胞所占比例明顯減少。

表1 各組MCF-7細胞周期的情況 %

2.5 劃痕愈合實驗結果 實驗組劃痕愈合率為(37.48±0.21)%，較陰性對照組[(60.35±2.29)%]明顯降低(t=17.225,P<0.001)。見圖1。

A:0 h；B:48 h；1：陰性對照組；2：實驗組。圖2 劃痕愈合實驗結果

3 討論

最早被發現的miRNA家族成員lin-4，是在線蟲中通過胚胎發育時間控制缺陷性遺傳篩選實驗[6]所鑒定的。現在被發現的miRNAs已有2 000多種，存在于人類和幾乎所有的模式生物中，并在細胞增殖、分化和凋亡等細胞生物學進程中發揮著重要的調控作用[7]。Tang等[8]研究表明，miRNA-1258在乳腺癌組織中低表達，且主要將細胞周期阻滯于G1期而影響細胞的增殖。Liu等[9]發現三陰性乳腺癌組織中的miR-26a明顯低表達，并且與淋巴結轉移和預后相關，在三陰性乳腺癌細胞株中上調miR-26a的表達可以降低其增殖和侵襲的能力。李秀娟等[10]研究表明miR-34a過表達可增加乳腺癌細胞對阿霉素的藥物敏感性。另一方面，一些miRNAs被證實在乳腺癌中表達上調。Zhang等[11]認為miR-155可以促進細胞增殖而起到癌基因的作用。Dong等[12]的研究表明，miR-21在三陰性乳腺癌中高表達，并可通過促進細胞增殖及抑制細胞凋亡而起到癌基因的作用。

多項研究表明，miR-214在腫瘤中低表達。張麗靜等[13]采用脂質體轉染的方法將miR-214模擬物轉入人結腸癌HCT116細胞，通過MTT法、FCM 法及平板克隆形成實驗證實，miR-214可抑制人結腸癌HCT116細胞的增殖并促進其凋亡。miR-214過表達可以抑制細胞的增殖、侵襲和遷移[14]。Long等[15]研究表明過表達miR-214可以抑制大腸癌細胞增殖、促進細胞凋亡。該研究結果顯示實驗組細胞中miR-214的表達明顯升高，表明轉染成功；miR-214可以抑制細胞的增殖及凋亡，將細胞阻滯在G1期，與Zhang等[11]認為的S期阻滯不同，這可能與細胞特異性有關。劃痕愈合實驗結果表明實驗組較陰性對照組劃痕愈合率降低，提示miR-214過表達可以抑制細胞的遷移。

總之，miR-214可能通過抑制乳腺癌細胞MCF-7增殖及遷移，促進細胞凋亡，且主要將細胞周期阻滯于G1期而發揮抑癌作用，但具體調控的靶基因及參與調節的信號通路仍待進一步研究。

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[13]張麗靜,吳晨鵬,張志勇,等.MiR-214對人結腸癌HCT116細胞生物學功能的影響[J].腫瘤,2013,33(11):966

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(2016-07-13收稿 責任編輯李沛寰)

Effect of miR-214 on biological function in breast cancer MCF-7 cells

TIANYanfeng,LIFang,LIUBo,ZHAOZengren,DAIYongjun,WEIMing

DepartmentofGeneralSurgery，theFirstHospital，HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050031

breast cancer;microRNA;MCF-7 cell;cell proliferation

Aim: To explore the effect of microRNA-214(miR-214) on the proliferation, apoptosis, migration and cell cycle distribution of human breast cancer MCF-7 cells. Methods: The miR-214 mimics were transfected into MCF-7 cells(experimental group) through liposome transfection, and the MCF-7 cells transfected by miR-214 negative control were used as control. The expression of miR-214 level was detected by real-time fluorogenic quantitative-PCR. The change of proliferation ability of MCF-7 cells was detected by CCK-8 method. The changes of apoptosis and cell cycle distribution were examined by flow cytometry. The change of migration ability was detected by wound healing assay. Results: After transfection with miR-214 mimics, the expression level of miR-214 in MCF-7 cells was up-regulated.Compared with control, the cell proliferation of MCF-7 cells in experimental group was inhibited, the cell apoptosis rate was elevated(P=0.008) and the proportion of cells at G1phase increased, and that of cells at S phase decreased(P<0.05),besides, the migration ability was inhibited(P<0.001). Conclusion: MiR-214 may act as a tumor suppressor in MCF-7 cells through inhibiting cell proliferation and migration, promote cell apoptosis and affect cell cycle distribution.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.01.023

*河北省科技支撐計劃項目 14277755D

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