豐富環境對小鼠缺血性腦損傷后運動、社交功能的作用①

姜敏，王繼先，余波，楊國源，陳文華

豐富環境對小鼠缺血性腦損傷后運動、社交功能的作用①

姜敏1，王繼先2，余波1，楊國源3，陳文華1

目的研究長期豐富環境對促進小鼠缺血性腦損傷后運動、社交功能恢復的作用。方法成年雄性ICR小鼠16只，復制大腦中動脈永久性栓塞模型。術后第1天將小鼠分為豐富環境組(n=8)和標準環境組(n=8)。術后7 d、14 d、21 d、28 d對小鼠進行改良神經損害嚴重程度評分(mNSS)，進行疲勞轉棒儀、聰明籠子檢測。結果術后28 d，豐富環境組mNSS評分與轉棒疲勞試驗結果優于標準環境組(t＞2.927,P＜0.05)。一般運動試驗中，術后14～28 d，豐富環境組在聰明籠子中間區域出現的時間長于標準環境組(t＞2.480,P＜0.05)；社交行為試驗中，術后7～28 d，豐富環境組比標準環境組表現出對陌生小鼠更感興趣的趨勢，但無顯著性差異(P＞0.05)；術后14～28 d，豐富環境組出現在中間區域的時間明顯長于標準環境組(t＞3.472,P＜0.01)；術后14 d在聰明籠子中的移動速度高于標準環境組(P＜0.05)。結論豐富環境有助于小鼠缺血性腦損傷后運動功能恢復，并可能促進其社交功能恢復。

缺血性腦損傷；豐富環境；運動；社交；行為；小鼠

[本文著錄格式] 姜敏，王繼先，余波，等.豐富環境對小鼠缺血性腦損傷后運動、社交功能的作用[J].中國康復理論與實踐, 2017,23(1):32-36.

CITED AS:Jiang M,Wang JX,Yu B,et al.Effect of enriched environment on motor and social function after ischemic brain injury in mice[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(1):32-36.

腦卒中是一種由腦供血障礙導致的急性綜合征，其中約80%為供血受阻導致的缺血性腦卒中[1]。康復訓練在腦卒中后功能恢復中發揮重要作用，絕大多數患者可以通過康復訓練達到生活自理。除常規康復訓練及治療可以幫助腦卒中患者外，改善患者的社交及生活環境也可以影響功能恢復的進程[2-3]。

在動物實驗中，豐富環境是一種很好的促進功能恢復的治療方式，它通過為實驗動物提供較大的活動空間、多種玩具，增強對動物運動、感覺、認知及社交的刺激，激發其對新環境的探索欲望，從而引發自主運動，達到促進動物社交、感覺與運動功能恢復的效果?，F有的研究表明，豐富環境不僅可以在細胞和分子層面產生影響[4-6]，也可與多種其他治療相互作用[7]；不管是在腦缺血的急性期還是慢性期介入均可發揮一定的治療作用，即便在腦缺血前進行干預[8]，也可對動物有一定的保護作用。

本研究探討豐富環境對小鼠缺血性腦損傷后運動、社交功能恢復的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級雄性ICR小鼠16只，體質量25～30 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。造模后，小鼠分為豐富環境組和標準環境組，每組8只，術后第1天分別飼養于豐富環境或標準環境中。

1.2 實驗儀器與試劑

聰明籠子(smart cage)：AFASCI Inc.Burlingame, CA。手術顯微鏡：LEICA,Heerbrugg,Switzerland。Moor VMS-LDF激光多普勒血流儀：Moor Instruments,Aminster,Devon,UK。

1.3 模型制備

采用大腦中動脈永久性栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。氯胺酮100 mg/kg和甲苯噻嗪10 mg/kg麻醉并固定好動物。參照文獻[9]，分離頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈后，用一端包有硅膠的6-0絲線阻塞小鼠左側大腦中動脈。手術過程中通過電熱毯保持動物體溫(37±0.5)℃。通過激光多普勒血流儀檢測術前及術后同一部位，如血流降至術前20%以下為手術成功。

1.4 豐富環境與標準環境

豐富環境籠子40×30×40 cm，分為上下兩層，中間有塑料隧道、爬梯及平臺連接，兩層均放有不同顏色的玩具，如塑料隧道、小房子、小鼠跑輪、跑球、木質翹板等。每3天添加或移除一些玩具，并更換擺放位置。一般同時放入5～10只小鼠以保證對動物的社交刺激。

標準環境即為實驗小鼠常規飼養環境。

1.5 行為學評估

1.5.1 改良神經損害嚴重程度評分(modified Neurological Severity Score,mNSS)

mNSS可以綜合評估動物運動、感覺、反射及平衡能力，評分范圍0～18分[10]。分數越高表示損傷越重。評分由對實驗分組不知情的研究人員于造模術后7 d、14 d、21 d、28 d完成。

1.5.2 轉棒疲勞試驗[11]

術前3 d對動物進行訓練。第1天將小鼠放于靜止的轉棒上，使其停留30～60 s；然后使轉棒從5 r/min勻加速至20 r/min，掉落的動物重新放于轉棒上，直到可以停留60 s。第2及第3天的訓練改為從5 r/min勻加速至40 r/min。選擇第3天可以自主在轉棒上停留1～2 min的動物進行試驗，重復3次，取平均值。造模術后7 d、14 d、21 d、28 d，動物每天測試3次，間隔5～10 min，記錄動物停留的時間，取平均值。

1.5.3 聰明籠子

用來記錄小鼠的自主活動[12-14]。通過探測并記錄小鼠在不同區域的移動軌跡、距離、速度、活躍時間等參數，分析動物運動及社交功能。

聰明籠子自帶軟件可以將籠內區域橫向分為4個或縱橫分為9個區域。錯步模塊(foot drop)采用9分法，其中5區為籠內最中間的區域；社交行為模塊采用4分法，其中1區代表陌生小鼠區域，4區代表熟悉小鼠區域。

于造模術后7 d、14 d、21 d、28 d，通過錯步模塊記錄小鼠在籠內15 min內的一般運動情況，記錄5～10 min時間內停留在5區的時間；通過社交行為(social behavior)模塊對小鼠的社交行為進行檢測。社交行為檢測共30 min：將待測動物放入籠內適應環境10 min，再將其熟悉的正常小鼠放入掛在籠子一側的透明盒內(盒底部為鐵絲網，方便動物交流)10 min，在籠子的另一側放入相似體質量的陌生正常小鼠10 min，記錄實驗小鼠在籠內各區域的運動軌跡、速度及活躍時間。

1.6 統計學分析

應用SPSS 13.0統計軟件進行數據處理。計量資料用(±s)表示，組間比較采用成組比較t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 mNSS

術后28 d，豐富環境組mNSS評分明顯低于標準環境組(P＜0.01)。見表1。

表1 各組小鼠mNSS評分比較

2.2 運動功能

轉棒疲勞試驗顯示，豐富環境組術后28 d停留在轉棒上的時間長于標準環境組(P＜0.05)。見表2。

表2 各組小鼠在轉棒上停留時間比較(s)

聰明籠子錯步試驗顯示，豐富環境組術后14 d、21 d、28 d出現在第5區的時間均長于標準環境組(P＜0.05)。見表3。

表3 各組小鼠錯步試驗在5區停留時間比較(min)

2.3 社交功能

聰明籠子社交行為試驗顯示，豐富環境組術后14 d開始在1區停留的時間有降低趨勢，但與標準環境組無顯著性差異(P＞0.05)。見表4。

通過以下公式進一步分析放入陌生小鼠后實驗小鼠在1區出現的時間的變化率(A)，正值表示對陌生小鼠更感興趣。

其中zone110～20表示放入熟悉小鼠后實驗小鼠在1區停留的時間；zone120～30表示放入陌生小鼠后實驗小鼠在1區停留的時間。

處理后，豐富環境組總體上比標準環境組對陌生小鼠更感興趣。見表5。

通過對進行社交行為試驗的小鼠進行觀察，發現豐富環境組小鼠普遍較活躍，小鼠在1區停留時間降低可能為小鼠在籠內其他區域活動時間增多所致。使用9分法分析放入陌生小鼠后，實驗小鼠在5區停留時間所占的比率。結果顯示，從術后14 d開始，豐富環境組5區停留時間高于標準環境組。見表6。

結合實驗中觀察到豐富環境組小鼠不停往返穿行于1區與4區之間(4分法)，推測放入陌生小鼠后，實驗小鼠在1區和4區停留時間無顯著性差異的原因可能是由于豐富環境組運動功能恢復，在籠內各區活動均較活躍，從而掩蓋了社交行為的恢復水平。

我們對小鼠術后7 d和14 d進行社交行為試驗時的速度進行觀察，結果顯示，標準環境組7 d、14 d的速度沒有明顯改變，豐富環境組14 d時的速度高于標準環境組。提示運動功能于術后14 d開始恢復。見圖1。

表4 各組小鼠社交行為試驗在1區停留時間比較(min)

表5 各組小鼠社交行為試驗A值比較

表6 各組小鼠社交行為試驗放入陌生小鼠后實驗小鼠在5區停留時間比率比較

圖1 小鼠社交試驗造模術后7 d、14 d的移動速度

3 討論

環境可以影響身體健康的觀點已被多數人認可，豐富環境正是通過改變實驗動物的生存環境，發揮治療作用。在臨床工作中，腦卒中患者在醫院進行康復時多不積極，較好的環境及社交支持有利于提高患者的積極性與參與性，幫助改善患者的心情[2]，從而影響最終的治療效果。研究表明，豐富環境可以調節腦缺血后特定基因的表達[4,15-16]，減輕炎癥反應[17]，調控多種營養因子及再生過程[18]，引發突觸再生、膠質細胞再生、血管再生等一系列促進腦可塑性的過程[19-21]，最終使功能得到恢復。此外，豐富環境還可與多種治療協同作用[7]，共同促進腦缺血后的功能恢復，不管是在急性期、慢性期或缺血前[8]進行干預，均可發揮有益作用。

本研究發現，長期(28 d)豐富環境能明顯促進腦缺血小鼠運動功能恢復。

聰明籠子是一種可以記錄小鼠移動軌跡、距離、速度、活躍時間等參數，并對運動、社交等功能進行定量分析的實驗裝置。國外使用此裝置主要觀察動物在某一時間點的功能情況[22-23]，針對腦卒中后功能恢復的研究主要限于急性期[12]，缺乏對動物長期功能恢復的觀察。本研究對MCAO小鼠觀察28 d，著重分析長期豐富環境對小鼠運動、社交功能恢復的作用，發現豐富環境不僅有利于運動功能的恢復，對社交功能的恢復可能也有一定幫助。

聰明籠子的社交行為試驗與已經廣泛應用的物體識別試驗[24]相似，利用動物對新物體比舊物體有更大興趣的特點，研究動物的認知與記憶功能。在社交行為試驗中，將新、舊物體換為實驗動物陌生或熟悉的小鼠，觀察動物與同伴進行識別與交流的能力。

本研究發現，當籠內同時出現熟悉和陌生小鼠時，豐富環境組小鼠對陌生小鼠更感興趣，表現為在陌生小鼠所在區域停留時間較長，但這一差異隨時間逐漸減小。進一步分析發現，從術后14 d開始，豐富環境組小鼠出現在中間區域的時間長于標準環境組，移動速度高于標準環境組，提示豐富環境組運動功能恢復好于標準環境組；可能由于在籠內各區的活動均比較活躍，從而掩蓋了社交功能的真實恢復水平。

綜上所述，豐富環境有助于小鼠缺血性腦損傷后的功能恢復，在運動功能顯著恢復前，還可能對社交功能恢復產生有利作用。

臨床上很多患者在腦卒中后的康復治療中表現不積極，類似豐富環境的治療可以調動他們的治療積極性，達到促進功能恢復的目的[2,25]。

已有臨床研究表明，患者需要更接近日常生活的環境來幫助恢復受損功能，康復治療并非項目越多、治療強度越大，效果越好[3]。如何將豐富環境中關于運動、感覺、社交及認知等方面的有益刺激轉換到臨床治療中是需要今后探討和研究的問題。

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Effect of Enriched Environment on Motor and Social Function after Ischemic Brain Injury in Mice

JIANG Min1,WANG Ji-xian2,YU Bo1,YANG Guo-yuan3,CHEN Wen-hua1
1.Department of Rehabilitation Medicine,Shanghai General Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200080,China;2.Department of Rehabilitation Medicine,Shanghai Ruijin Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200025,China;3.Med-X Research Institute,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200030,China

CHEN Wen-hua.E-mail:chen.wh@163.com

ObjectiveTo explore the role of long-term enriched environment in promoting the recovery of motor and social function in mice after ischemic brain injury.MethodsSixteen adult male ICR mice underwent permanent middle cerebral artery occlusion(MCAO). The first day after operation,they were divided into enriched environment group(n=8)and standard condition group(n=8).The mice were tested with modified Neurological Severity Score(mNSS),rotarod test and smart cage 7,14,21,28 days after modeling.ResultsThe score of mNSS and the result of rotarod test improved more in the enriched environment group than in the standard condition group 28 days after MCAO(t＞2.927,P＜0.05).The occupancy time in the middle of smart cage was longer in the enriched environment group than in the standard condition group 7 to 28 days after MCAO(t＞2.480,P＜0.05)in the general move test.There was a trend of being more interested in strange mice in the enriched environment group than in the standard condition group,but the difference was not statistically significant(P＞0.05)in the social behavior test;however,the occupancy time in the middle of smart cage was longer in the enriched environment group than in the standard condition group 14 to 28 days after MCAO(t＞3.472,P＜0.01),and the velocity of moving was higher 14 days after MCAO(P＜0.05).ConclusionEnriched environment could promote the recovery of motor function,somehow of social function,in mice after ischemic brain injury.

ischemic brain injury;enriched environment;motor;sociality;behavior;mice

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.01.08

R743.3

A

1006-9771(2017)01-0032-05

2016-07-15

2016-10-26)

上海市科委產學研醫項目(No.11DZl921307)。

1.上海交通大學附屬第一人民醫院康復醫學科，上海市200080；2.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院康復醫學科，上海市200025；3.上海交通大學Med-X研究院，上海市200030。作者簡介：姜敏(1988-)，女，漢族，上海市人，碩士研究生，主要研究方向：神經康復。通訊作者：陳文華，女，漢族，主任醫師，教授。E-mail:chen.wh@163.com。