MicroRNA-21和microRNA-664減輕腎缺血再灌注損傷的研究*

胡紅林，習小慶，唐偉偉，葉真逢，黃雅為，林雙泉，項明峰

（南昌大學第二附屬醫院泌尿外科，江西南昌330006）

論著

MicroRNA-21和microRNA-664減輕腎缺血再灌注損傷的研究*

胡紅林，習小慶，唐偉偉，葉真逢，黃雅為，林雙泉，項明峰

（南昌大學第二附屬醫院泌尿外科，江西南昌330006）

目的探討microRNA-21和microRNA-664對腎缺血再灌注損傷（IRI）的影響。方法應用agomir-21和agomir-664預處理BALB/c小鼠，采用雙側腎蒂阻斷法復制小鼠腎IRI模型，小鼠腎缺血再灌注后24 h，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）法和Western blot檢測缺血后腎組織中microRNA-21和microRNA-664及其靶基因、靶蛋白的表達，觀察腎臟病理組織學的變化。結果agomir-21和agomir-664預處理BALB/c小鼠經腎IRI后，腎臟損傷減輕，表現為腎小管上皮細胞壞死降低，進一步檢測發現microRNA-21和microRNA-664的靶基因PTEN、PDCD4和MAPK表達降低，靶蛋白Caspase-3和ERK1/2表達受抑制。結論MicroRNA-21和microRNA-664可以通過調控其靶基因、靶蛋白的表達，從而減輕腎缺血再灌注損傷。

腎缺血再灌注損傷；microRNA-21；microRNA-664

筆者前期研究采用microRNA基因芯片技術檢測雌雄小鼠腎缺血再灌注損傷后腎組織中microRNA-21（miR-21）和microRNA-664（miR-664）的表達存在明顯性別差異表達[7]。基于此，本研究進一步探討miR-21和miR-664對腎缺血再灌注損傷的調控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

雄性BALB/c小鼠，年齡8～10周，體重20～25g，購自南昌大學實驗動物學科部。agomir-21、agomir-664、miRNA引物、U6及miRNA相關調控基因購自廣東銳博有限公司，蛋白提純試劑盒購自湖北武漢博士德生物工程有限公司，兔抗鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）抗體、兔抗鼠細胞外信號調節激酶1/2（extracellular-signal-regulated kinase1/2，ERK1/2）抗體購自湖北武漢博士德生物工程有限公司，辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國TRANS公司，ECL免疫檢測試劑盒購自美國Pierce公司

1.2 實驗分組

雄性BALB/c小鼠按以下方案分組。Ⅰ組：agomir-21+IRI 0 min組（n=10）；Ⅱ組：磷酸緩鹽沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）+IRI 0 min組（n= 10）；Ⅲ組：agomir-664+IRI 0 min組（n=10）；Ⅳ組：agomir-21+IRI 45min組（n=10）；Ⅴ組：PBS+IRI 45 min組（n=10）；Ⅵ組：agomir-664+IRI 45 min組（n=10）。agomir-21和agomir-664，經腹腔注射，5 nmol/次，隔天1次，持續1周。

1.3 腎缺血再灌注損傷模型復制

隨著社會的不斷發展以及信息技術的不斷普及，將信息技術應用到教學中，已經成為當前教育界發展的必然趨勢。在開展小學語文教學的過程中，應用信息技術開展教學，能夠幫助教師營造合適的教學環境，激發學生的學習興趣。同時，通過信息技術，教師也能夠為學生提供充足的課外資源，豐富學生的知識儲備，在提升學生學習質量的同時，推動學生的綜合化發展。

動物術前禁食12 h后，10％水合氯醛溶液麻醉（9 ml/kg，腹腔注射）。取腹正中切口約2 cm，逐層分離進入腹腔，找到腎蒂，無損傷微型動脈夾阻斷雙側腎蒂，阻斷腎蒂45 min后去除動脈夾，恢復血流灌注（前期實驗表明：腎臟由鮮紅變紫黑色，表示腎缺血成功，恢復血供后，腎臟迅速由紫黑色變為鮮紅，恢復原來顏色[3]），術畢分層縫合關閉腹腔。假手術組找到腎蒂后不阻斷腎蒂血流，等待45 min后分層縫合關閉腹腔。術中應用生理鹽水使小鼠保持充分的水化。術后小鼠于24～29℃的環境保暖，補充水與飼料，術后小鼠存活24 h表示建模成功。

1.4 腎臟組織病理學檢查

手術后24 h，采用引頸法處死小鼠，取出腎臟，其中1個腎臟置于10％福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋，制作4μm切片，常規蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，進行Rabb半定量病理評估法評分（最高4分）[8]：正常腎臟形態為0分；最少壞死（＜5％的腎小管壞死）為1分；輕度壞死（5％～25％的腎小管壞死）為2分；中度壞死（25％～75％的腎小管壞死）為3分；重度壞死（＞75％的腎小管壞死）為4分。另一腎臟迅速冷凍保存于液氮，再轉移至-80℃冰箱冷凍保存做后續相關檢測。

1.5 總RNA提取和質量檢測

腎組織約100 mg放入勻漿器中，并加入1 ml Trizol液，充分勻漿，進行樣品量及質量檢測，包含OD260、OD280、OD230、AgaroseElectrophoresis及Agilent Bioanalyzer等測試，檢驗RNA樣品的濃度、純度及完整性。

1.6 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測

取一定量的腎組織，依據TRANS公司產品說明書用Trizol液裂解，氯仿抽提總RNA，miRNA、內參U6及miRNA相關調控基因逆轉錄反應合成模板cDNA，置入-20℃冰箱冷凍保存。聚合酶鏈反應（PCR）循環次數為40次，提供的數據采用2-△△CT法分析。以20μl反應體系進行PCR，取2μl逆轉錄反應產物分別與miR-21引物、miR-664引物、內參照U6引物、第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）引物、程序性細胞凋亡因子4（programmed cell death protein 4，PDCD4）引物、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）引物、β-肌動蛋白引物進行反應，反應條件按miRNA qRT-PCR使用說明書在ABI PRISM 7300 Real time PCR System上操作。

1.7 Western blot檢測Caspase-3及ERK1/2蛋白表達水平

按蛋白提純試劑盒說明書進行細胞裂解液中的蛋白提純，應用考馬斯亮蘭法測定蛋白濃度。蛋白質孔上樣后，經10％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移至硝酸纖維素膜。硝酸纖維素膜經5％脫脂牛奶封閉過夜，分別用兔抗鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）抗體、兔抗鼠細胞外信號調節激酶1/2（ERK1/2）抗體（1∶400），4℃孵育過夜。加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗。按照ECL免疫檢測試劑盒操作說明書進行顯色、曝光、X光片沖洗，掃描后采用Image Pro Plus測量條帶灰度值。

1.8 統計學方法

采用Graph Pad 5.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，計量資料組間比較用t檢驗或Mann-WhitneyU非參數檢驗，計數資料用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 注射agomir試劑后各組腎臟病理組織學評估

各組腎臟經HE染色后在顯微鏡下病理組織學評估，隨機選取10個視野采用Rabb病理評估方法顯示：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組腎組織基本正常，僅見部分腎小管上皮細胞水腫。Ⅴ組腎小管上皮細胞壞死、崩解脫落以及細胞核濃縮、碎裂、核溶解，部分腎小管管腔擴張、管腔輪廓模糊，病理損傷范圍＞75％；而Ⅳ組和Ⅵ組可見腎小管上皮壞死明顯減輕。見圖1A。

Ⅰ組與Ⅱ組、Ⅱ組與Ⅲ組，腎小管病理損傷評分比較，差異無統計學意義（P=0.591和0.557）；但Ⅳ組（3.112±0.151）與Ⅴ組（3.860±0.131）比較，腎小管病理損傷評分降低，差異有統計學意義（P= 0.010）；同樣，Ⅵ組（3.230±0.163）與Ⅴ組（3.860± 0.131）比較，腎小管病理損傷評分也降低，差異有統計學意義（P=0.013）。見圖1B。

2.2 注射agomir試劑后各組腎臟組織中miR-664及miR-21相對表達量

為了檢測注射藥物干預前后miR-21、miR-664的表達，采用qRT-PCR檢測腎臟中miR-664及miR-21表達，結果顯示，miR-664的表達量Ⅲ組（1.63±0.123）與Ⅱ組（1.0）相比上調，差異有統計學意義（P=0.012）；Ⅵ組（2.53±0.066）與Ⅴ組（2.07± 0.159）miR-664的表達量相比上調，其表達量差異有統計學意義（P=0.035）。見圖2A。miR-21的表達量Ⅰ組（1.63±0.087）與Ⅱ（1.0）相比上調，差異有統計學意義（P=0.011）；Ⅳ組（2.09±0.100）與Ⅴ組（1.56±0.122）miR-21的表達量相比上調，差異有統計學意義（P=0.021）。見圖2B。

2.3 注射agomir試劑后各組腎臟組織中PTEN、PDCD-4以及MAPK mRNA的表達

為了檢測miR-21的靶基因PTEN、PDCD-4和miR-664的靶基因MAPK的表達量，采用RT-qPCR檢測各組腎臟中PTEN、PDCD-4以及MAPK的mRNA表達。結果顯示，PTEN、PDCD-4的表達量Ⅰ組[（0.91±0.067）、（0.93±0.051）]與Ⅱ組（1.0）比較，差異無統計學意義（P=0.136和0.251），見圖3A、B；MAPK的表達量Ⅲ組（0.92±0.079）與Ⅱ組（1.0）比較，差異無統計學意義（P=0.223），見圖3C。PTEN、PDCD-4的表達量Ⅳ組[（0.33±0.075）、（0.30± 0.051）]與Ⅴ組[（0.53±0.066）、（0.50±0.061）]比較，差異有統計學意義（P=0.036和0.034），見圖3A、B；MAPK的表達量Ⅵ組（0.28±0.066）與Ⅴ組（0.50±0.060）比較，差異有統計學意義（P=0.032），見圖3C。

圖1 BALB/c小鼠雙側腎蒂阻斷45 min，恢復血流灌注后24 h腎臟病理組織學評估

圖2 BALB/c小鼠雙側腎蒂阻斷45 min，恢復血流灌注后24 h

圖3 BALB/c小鼠雙側腎蒂阻斷45 min，恢復血流灌注后24 h

圖4 BALB/c小鼠雙側腎蒂阻斷45 min，恢復血流灌注后24 h腎臟中Caspase-3、ERK1/2蛋白的表達

2.4 注射agomir試劑后各組腎臟組織中Caspase-3以及ERK1/2蛋白的表達

采用Western blot法檢測各組腎臟組織中Caspase-3以及ERK1/2蛋白的表達，結果顯示，各組腎組織中pro-Caspase-3蛋白的表達量差異無統計學意義；而與Ⅴ組比較，Caspase-3剪切片段P17的表達量在Ⅳ組受抑制（P=0.039），ERK1/2蛋白的剪切片段P42、P44的表達量在Ⅵ組也降低（P=0.031和0.026）。見圖4。

3 討論

心、腦、肺等多種器官IRI研究中均存在性別差異，大量的臨床案例及動物實驗也證實腎IRI存在明顯性別差異，雌性對IRI的耐受性明顯強于雄性；而且筆者前期實驗證實雌性和雄性小鼠腎缺血45 min是復制動物模型理想的腎缺血時間[3]。

何種機制導致腎IRI存在性別差異呢？文獻報道等[9]通過構建雌雄小鼠腎缺血55 min再灌注2 h和16 h模型發現，雌雄鼠腎臟組織中Na+K+ATP酶（以下簡稱NKA）的mRNA存在差異，但在腎缺血再灌注后該差異更加明顯，而NKAα1蛋白在腎缺血再灌注前表達相似，但在缺血再灌注損傷后雌性表達明顯升高，這說明NKAα1蛋白和mRNA的更高表達有助于改善雌鼠腎缺血后腎功能。另一方面，雌激素可能通過維持Na+Ca2+交換器從而對腎缺血再灌注損傷起保護作用[10-11]。KANG等[12]研究表明，去勢的雄性大鼠可以減輕大鼠腎缺血后的炎癥反應和腎小管損傷，補充睪酮可以逆轉此保護作用；而切除卵巢后的雌性大鼠腎缺血后炎癥反應和腎小管損傷均明顯加重，同樣補充雌激素可以逆轉此損傷，他們認為雄性大鼠對腎缺血更敏感是由于缺血后腎臟增強了炎癥反應。PARK等[1]通過研究認為，體內睪酮出現而不是雌激素缺乏使小鼠對腎缺血再灌注損傷更敏感，睪酮可以通過非雄激素受體介導的機制減少腎缺血誘導的一氧化氮合酶、磷酸化蛋白激酶（protein kinase B，Akt）激活和缺血后ERK/JNK磷酸化比率的上升引起的炎癥反應而增加腎臟缺血損傷。所以，腎缺血再灌注損傷性別差異的具體機制仍有待于進一步闡明。

miRNA的研究已經成為近年來生命科學領域中的一個重要方向，miRNA廣泛存在于動物、植物、病毒等多種有機體中[13-14]。miRNA參與維持機體多種器官功能、細胞分化、增殖以及免疫系統的發展[15-16]。為進一步研究腎缺血再灌注損傷性別差異的機制，筆者前期研究從miRNA著手，對不同性別的小鼠腎組織中miRNA表達譜進行對比研究，在閾值為1.5時，發現miR-21和miR-664在各組腎臟組織中的表達差異有統計學意義，其中雄性假手術組與雌性假手術組相比miR-21和miR-664表達相近，雄性IRI 45 min組與雄性假手術組相比上調約1.5倍和1.3倍，而雌性IRI 45 min組與雄性假手術組相比miR-21和miR-664表達倍數約2和2.2倍，進一步采用定量PCR驗證結果跟基因芯片結果基本一致[7]。所以本實驗將進一步著重研究miR-21和miR-664對腎缺血再灌注損傷的影響。

miR-21及miR-664在腎缺血再灌注損傷中如何發揮其作用機制呢？目前，文獻資料表明miR-21是一個強大的抗凋亡因子[17-18]，可以通過負向調控其靶基因PTEN和PDCD4。最近研究表明，miR-21在小鼠腎小管上皮細胞[17]和小鼠腎組織[19]中主要通過下調PDCD4表達而抑制細胞凋亡。PTEN主要是負向調控磷脂酰肌醇3-激酶PI3K/AKT信號通路抑制細胞凋亡[20]。SAYED等[21]研究發現，轉基因小鼠心肌組織中miR-21過表達可以抑制缺血誘導的PTEN和Fas配體（FasL）上調以及Akt磷酸化，從而起到抑制細胞凋亡的作用。JIA等[22]應用anti-miR-21敲除小鼠腎臟中miR-21，發現缺血腎組織中PDCD4和PTEN表達明顯下調，而使腎臟中腎小管細胞凋亡加重。隨著PDCD4及PTEN的下調，程序性凋亡因子Caspase-3表達會明顯降低，而另一方面Caspase-3處于凋亡有序級聯反應的下游，是最重要的效應型Caspase，是Caspase家族中細胞凋亡的關鍵執行者，是細胞凋亡過程中的主要效應因子[23]。WANG等[24]研究表明，miR-664可以通過負向調控其靶基因MAPK從而調控葡萄糖的代謝，進一步研究發現MAPK基因通過調控ERK蛋白可進一步調控腎臟對缺血再灌注損傷的敏感性及耐受性，然而miR-664在腎缺血再灌注損傷中的作用的相關報道甚少。

在本研究中，筆者通過注射agomir分子誘導雄性BALB/c小鼠腎組織中缺血前過表達miR-21及miR-664。結果發現：與相應對照組比較，應用agomir-21或agomir-664后腎組織中miR-21或miR-664表達量升高，差異有統計學意義，表明agomir分子的作用是明確有效的。各組腎組織病理組織學評分表明，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組腎組織基本正常，僅見部分腎小管上皮細胞水腫，Ⅳ組和Ⅵ組可見腎小管上皮細胞壞死、空泡變性以及細胞核濃縮、碎裂、核溶解，病理損傷范圍在25％～75％；Ⅴ組腎小管上皮細胞壞死、崩解脫落以及細胞核濃縮、碎裂、核溶解，部分腎小管管腔擴張、管腔輪廓模糊，病理損傷范圍＞75％，進一步證明使用agomir-21及agomir-664能有效上調腎組織中miR-21、miR-664的表達，而且上調miR-21及miR-664后，小鼠腎對缺血再灌注損傷的耐受性明顯提高。同時Ⅰ組PTEN、PDCD4和Ⅲ組MAPK的表達量與Ⅱ組比較，差異無統計學意義；Ⅳ組PTEN、PDCD4的表達量低于Ⅴ組，差異有統計學意義；Ⅵ組MAPK的表達量低于Ⅴ組，差異有統計學意義。Westren blot結果顯示，Ⅳ組Pro-Caspase-3的表達量與Ⅴ組比較，差異無統計學意義，而cleaved Caspase-3 P17的表達量比較，差異有統計學意義；Ⅵ組cleaved ERK1/2 P42、P44的表達量與Ⅴ組比較，差異有統計學意義。由此筆者推斷：①miR-21通過負向調控其靶基因PDCD4及PTEN，從而影響Caspase-3的表達，進一步影響腎缺血再灌注損傷的程度；②miR-664通過負向調控其靶基因MAPK，進一步調控凋亡蛋白ERK蛋白表達，進而影響腎缺血再灌注損傷的程度。

綜上所述，miR-21及miR-664可能在腎缺血再灌注損傷過程中扮演著重要角色。可以通過調控miR-21或miR-664，從而逆向調控其靶基因和靶蛋白，進而改變腎臟對缺血再灌注損傷的敏感性，其有望為腎缺血再灌注損傷的防治提供新的靶標。

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（張蕾 編輯）

MicroRNA-21 and microRNA-664 relieve renal ischemia-reperfusion injury*

Hong-lin Hu,Xiao-qing Xi,Wei-wei Tang,Zhen-feng Ye, Ya-wei Huang,Shuang-quan Lin,Ming-feng Xiang
(Department of Urology,the Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang,Jiangxi 330006,China)

ObjectiveTo explore the effect of microRNA-21 and microRNA-664 on renal ischemia-reperfusion injury(IRI).MethodsAgomir-21 and agomir-664 were used to pretreat BALB/c mice.The method of bilateral renal pedicle occlusion was adopted to establish the renal IRI model in mice.At the 24th h after renal IRI,the expressions of microRNA-21 and microRNA-664,and their target genes and proteins in the kidneys were detected by real-time fluorescent quantitative PCR and Western blot.The histopathological changes of the kidneys were observed.ResultsRenal damage was significantly reduced in mice pretreated with agomir-21 and agomir-664,characterized by reduced necrosis of renal tubular epithelial cells.Further study showed that the expressions of microRNA-21 and microRNA-664 and their target genesPTEN,PDCD4andMAPKwere decreased,the expressions of their target proteins Caspase-3 and ERK1/2 were suppressed.ConclusionsMicroRNA-21 and microRNA-664 can reduce renal ischemia-reperfusion injury through regulation of the expressions of their target genes and proteins.

renal ischemia-reperfusion injury;microRNA-21;microRNA-664

R-332

：A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.02.003

1005-8982（2017）02-0019-07

2016-08-18

江西省自然科學基金（No：20132BAB205009）

習小慶，E-mail：xixiaoqing500@sina.com