microRNA在肥胖大鼠脂肪組織中的差異表達

支翠菊，黃 瑛，祁煒罡，張代富

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microRNA在肥胖大鼠脂肪組織中的差異表達

支翠菊，黃 瑛，祁煒罡，張代富

目的 建立高脂飲食誘導的大鼠肥胖模型，初步探討肥胖大鼠脂肪細胞、體質量、體長、血糖、血脂的變化，為進一步研究microRNA在肥胖誘發脂類代謝紊亂的相關分子機制奠定基礎。方法 將40只雄性SD大鼠隨機分為普通飲食組和高脂飲食組，分別以基礎飼料和高脂飼料喂養，尾靜脈采血檢測造模前及4周、8周的血糖、血脂水平，8周時眼眶放血處死大鼠；用動物電子秤稱量大鼠體重；留取大鼠網膜脂肪組織，用皿式電子分析天平稱重，并將其保存在-80 ℃液氮中備用，油紅染色光學顯微鏡觀察脂肪組織形態，采用微距陣基因芯片技術篩選肥胖大鼠模型的網膜脂肪組織差異表達的microRNA，Real-Time PCR驗證結果。結果 建模8周末，高脂飲食組大鼠體重、網膜組織重量、三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白均高于普通飲食組(P<0.01)，高密度脂蛋白低于普通飲食組(P<0.01)。基因芯片檢測并經Real-Time PCR驗證發現，高脂飲食組大鼠網膜組織中有13個差異表達的microRNA，其中microRNA30a、microRNA7e、microRNA30c、microRNA335、microRNA103、microRNA107、microRNA139-5p表達上調，microRNA494、microRNA140、microRNA342-5p、microRNA382、microRNA17-1-3p、microRNA92a表達下調。生物信息學分析發現，差異表達的microRNA調控的靶基因與細胞增殖、凋亡、糖代謝及調節脂肪細胞分化和脂類代謝生物學功能相關。結論 高脂誘導的肥胖模型大鼠網膜組織中microRNA表達譜發生明顯改變，提示microRNA能夠調節脂肪細胞分化和脂類代謝。

肥胖；microRNA；基因芯片；血糖；血脂

隨著全球經濟的快速發展，肥胖已是全世界面臨的嚴峻問題，在發展中國家，超重及肥胖的發病率逐年上升。世界衛生組織(WHO)明確認定肥胖是全球成年人面臨的最大慢性疾病，為世界四大醫學社會問題之一。中心性肥胖引起胰島素抵抗伴隨胰島細胞功能障礙，釋放胰島素減少，不能有效地控制血糖水平，進而加速了2型糖尿病的進程，尋找肥胖治療的新靶點顯得很重要[1]。microRNA是一類內源性產生的單鏈小分子RNA，能夠與目標microRNA轉錄的互補基因序列結合，進而通過轉錄抑制和MicroRNA干擾導致基因沉默，從而參與和調控了包括時序發育、細胞凋亡、脂肪代謝、神經元發育、細胞分化、激素分泌等在內的多種生理過程以及多種疾病發生過程[2-3]。近年來，大量研究證明肥胖與某些特異的microRNA有關[4]。但是目前采用芯片來篩查肥胖大鼠脂肪組織中差異表達的microRNA的報道并不多見。本課題建立高脂飲食誘導的大鼠肥胖模型，通過microRNA芯片技術篩查肥胖大鼠網膜脂肪組織中差異表達的microRNA，尋找肥胖誘發脂類代謝紊亂相關的microRNA，從而了解調控脂肪細胞生長的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40只健康雄性斷乳SD大鼠，6周～7周齡，體重220 g±25 g，斯萊克公司提供，許可證號：SCXK(滬)2012-0002。按體重隨機分為對照組(普通飼料喂養)和模型組(高脂飼料喂養)，SPF清潔級百級中分籠喂養，每籠3只～8只，飼料、飲水、墊料、籠具均經消毒滅菌后使用，嚴格執行清潔級實驗動物操作規程，12 h明暗循環，動物自由進食水。

1.2 飼料配方 采用合成飼料喂養大鼠，其中所含營養素和能量能保證大鼠生長發育的基本要求，在此基礎上調整脂肪和淀粉含量，配出高脂飼料。普通飼料由斯萊克公司提供，熱量比：蛋白質28%，脂肪12%，碳水化合物60%；高脂飼料由斯萊克公司提供：100 g高脂飼料包括基礎飼料55 g，豬油30 g，奶粉10 g，蛋黃粉5 g。熱量比：蛋白質20%，脂肪60%，碳水化合物20%。

1.3 方法

1.3.1 大鼠肥胖模型的建立 將40只雄性斷乳SD大鼠分為普通飲食組和高脂飲食組，分別以基礎飼料和高脂飼料喂養8周。每周稱重、測量體長1次，并觀察精神狀態、引水量、尿量、食欲、大便、毛發光亮度、皮毛、活動、眼睛等。空腹尾靜脈采血檢測造模前及4周、8周的血糖、血脂水平。造模評定標準：大鼠體重超過標準體重的20%即達到肥胖標準。8周后眼眶放血處死大鼠；用動物電子秤稱量大鼠體重；留取大鼠網膜脂肪組織，用皿式電子分析天平稱重，并將其保存在-80 ℃液氮中備用。

1.3.2 microRNA芯片檢測 microRNA芯片由國藥集團提供。用Trizol試劑(國藥集團)按照說明書提取大鼠網膜脂肪組織總RNA，用分光光度計測定RNA溶液在260 nm和280 nm下的吸光度值，檢測 RNA的濃度和純度。用1.5%的甲醛變性凝膠電泳(120 V)15 min，在凝膠成像儀下檢測總 RNA中 28 s和18 s的完整性。按說明書進行microRNA芯片雜交及芯片洗滌和掃描。高脂飲食組標準值與普通飲食組標準值相比高于2倍或低于0.5倍即認為存在顯著性上調或下調趨勢。

2 結 果

2.1 肥胖大鼠體重的變化 實驗前，普通飲食組和高脂飲食組大鼠體重差異無統計學意義(P>0.05)。高脂飲食8周后，高脂飲食組大鼠體重較普通飲食組增加了43．80%，差異有統計學意義(P<0.01)。詳見表1。

組別時間n體質量(g)體長(cm)普通飲食組0周19244.55±8.7318.94±1.734周19320.22±5.0523.17±1.388周19385.92±26.5225.68±1.31高脂飲食組0周18246.56±6.0218.72±1.454周18351.72±5.9925.06±1.088周18 473.25±48.501)28.89±1.90 與普通飲食組同時間比較,1)P<0.01。

2.2 油紅染色后光學顯微鏡觀察大鼠網膜脂肪組織細胞的比較 與普通飲食組大鼠相比，高脂飲食組大鼠網膜組織的脂肪細胞更大、更圓、更密集。詳見圖1。

圖1 油紅染色后光學顯微鏡觀察大鼠網膜脂肪組織細胞

2.3 肥胖大鼠網膜脂肪的變化 高脂飲食8周后，高脂飲食組大鼠網膜脂肪組織重量是普通飲食組的3倍，差異有統計學意義(P<0.01)。詳見表2。

表2 兩組大鼠網膜脂肪重量及其重量系數比較

2.4 兩組大鼠不同時期的血糖值比較 8周時，高脂飲食組大鼠血糖高于普通飲食組，差異有統計學意義(P<0.01)。詳見表3。

mmol/L

2.5 兩組大鼠不同時期血脂指標比較 8周時，高脂飲食組大鼠三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)均高于普通飲食組，高密度脂蛋白(HDL)低于普通飲食組，差異有統計學意義(P<0.01)。詳見表4。

mmol/L

2.6 大鼠網膜脂肪組織中差異表達的microRNA 通過microRNA芯片對468個microRNA分析，與普通飲食組相比，高脂飲食組大鼠差異表達的microRNA共有13個，其中上調7個，下調6個。詳見表5。

microRNA差異表達的microRNA高脂飲食組/正常飲食組上調的microRNA microRNA30a3.17±0.380.0392 microRNA7e2.68±0.240.0387 microRNA30c1.72±0.120.0382 microRNA3352.23±0.150.0368 microRNA1032.57±0.090.0182 microRNA1073.22±0.180.0164 microRNA139-5p4.54±0.670.0096下調的microRNA microRNA4940.76±0.110.0446 microRNA1400.67±0.060.0438 microRNA342-5p0.42±0.080.0273 microRNA3820.31±0.070.0244 microRNA17-1-3p0.58±0.040.0228 microRNA92a0.38±0.130.0184

3 討 論

目前世界上有11億人口超重或肥胖，研究證明肥胖與2型糖尿病、心血管疾病甚至惡性腫瘤有一定的相關性，肥胖已成為一個全球性的健康問題。肥胖的標志就是脂肪細胞體積的增大或細胞數目的增加，因此尋找肥胖的分子生物學機制對于治療或控制肥胖至關重要。研究表明非蛋白編碼的microRNA作為轉錄后調節基因參與脂肪細胞的形成過程[5]，在肥胖及與之相關的胰島素抵抗和2型糖尿病的病理生理過程中發揮著重要的調節作用。胰島素信號轉導缺陷是最常見的最早的導致個體發展為2型糖尿病的眾多缺陷之一，microRNA已經被認定為是一類新的影響許多生物功能的調節分子，包括代謝過程[6-7]。然而，通過microRNA直接調節胰島素敏感性在體內還沒有被證實[8]。瑞士聯邦理工學院分子生理學者Markus Stoffel和他的同事們進行了基因表達分析，發現microRNA 103和107在患有脂肪肝病的老鼠和人類體內都上調表達，而脂肪肝病是胰島素抗性和糖尿病的先兆，microRNA導致胰島素抗性，Stoffel等使用一種病毒載體在健康老鼠體內表達這兩種microRNA，結果它們很快產生高血糖癥狀，通過喂食高脂肪食物變胖，并在這肥胖老鼠體內沉默這兩種microRNA的表達，結果都顯示這兩組老鼠肝細胞和脂肪細胞中葡萄糖代謝得到了改善[9-10]。 研究人員們隨后通過基因表達實驗確定出這兩種microRNA通過關閉脂肪細胞中小窩蛋白-1(caveolin 1)能穩定胰島素受體的膜蛋白表達來降低胰島素敏感性[10]。

用高脂、高能量攝食誘導的肥胖動物模型符合人類發病過程，是研究人類肥胖的理想動物模型，目前暫無報道采用芯片來篩查肥胖大鼠脂肪組織中差異表達的microRNA。microRNA在許多疾病過程的研究雖然剛剛起步卻立即成為熱點，然而，還有許多問題亟待解決。microRNA越來越被認定可以作為一種新的調節分子從而影響多種生物學功能，但是并沒有很多的證據表明在肥胖及與之相關的胰島素敏感性甚至2型糖尿病、冠心病方面有直接的調節作用[11-13]。本研究旨在建立高脂飲食誘導的大鼠肥胖模型，觀察高脂飲食組與普通飲食組脂肪細胞的形態變化，對兩組大鼠體質量、體長、網膜脂肪重量及血脂水平進行比較，在飼養第8周兩組比較差異有統計學意義，通過microRNA芯片對468個microRNA分析，發現和普通飲食組相比，高脂飲食組大鼠差異表達的microRNA共有13個，其中上調7個，下調6個。本研究通過microarrayRNA印跡芯片技術篩查肥胖大鼠網膜脂肪組織中差異表達的microRNA，尋找肥胖誘發脂類代謝紊亂相關的microRNA，并通過Real-Time PCR驗證，最終找到目的基因；從而了解調控脂肪細胞的生長的機制，初步探討microRNA在肥胖大鼠中的作用，為進一步研究microRNA在誘發脂類代謝紊亂的相關分子機制奠定基礎。

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(本文編輯郭懷印)

浦東新區科技發展基金創新資金資助項目(No.PKJ2012-Y16)

上海浦東新區人民醫院(上海 021200)

張代富，E-mail：zhicuiju6@sina.com

R329

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.01.011

1672-1349(2017)01-0040-04

2016-04-05)

引用信息：支翠菊，黃瑛，祁煒罡，等.microRNA在肥胖大鼠脂肪組織中的差異表達[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2017，15(1)：40-43.