何首烏飲對衰老大鼠生精細胞凋亡的影響

王建明 回陳紅 劉昊坤 杜云帆 秦瑄希 牛嗣云

(河北大學醫學院組織學胚胎學教研室，河北 保定 071000)

何首烏飲對衰老大鼠生精細胞凋亡的影響

王建明1回陳紅 劉昊坤2杜云帆2秦瑄希2牛嗣云

(河北大學醫學院組織學胚胎學教研室，河北 保定 071000)

目的 探討何首烏飲對衰老大鼠睪丸生精細胞凋亡的影響。方法 選用18月齡Wistar大鼠為自然衰老動物模型，以12月齡大鼠作為青年對照，采用原位末端標記法和流氏細胞術分別檢測何首烏飲灌胃用藥60 d和30 d的18月齡大鼠睪丸組織細胞凋亡率變化和DNA含量的變化。結果 與青年對照組相比，自然衰老組睪丸細胞凋亡率明顯增高，單倍體和4倍體細胞明顯減少并以二倍體為主，G1/G0期細胞明顯增多(P<0.05)，細胞增殖指數明顯降低(P<0.05)；而何首烏飲用藥后與自然衰老組相比，細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；4倍體和單倍體比例明顯增加(P<0.05)，與青年對照組無顯著性差異(P>0.05)；細胞增殖指數明顯升高(P<0.05)，G1/G0期細胞明顯減少(P<0.05)。結論 何首烏飲可以抑制生精細胞凋亡，促進細胞增殖，達到延緩睪丸組織衰老的效果，但其具體作用機制有待研究。

何首烏飲；睪丸組織；細胞凋亡；衰老

細胞凋亡在清除發生異常的生精細胞，調節精子的數量和質量方面具有重要作用〔1〕。隨著增齡，睪丸組織生精細胞過度凋亡，使精子數量明顯減少，異常精子數明顯增多〔2〕，其中精原細胞特別是A型精原細胞凋亡是導致精子異常的主要原因〔3〕。目前，關于何首烏飲對睪丸組織細胞凋亡研究報道較少，本研究觀察何首烏飲對自然衰老大鼠睪丸組織細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 何首烏飲(SWY)方劑(河北省中醫院)，原位末端標記試劑盒(羅氏，美國),細胞周期檢測試劑盒和FACS420 型流式細胞儀(Becton Dickinson，美國)，激光共聚焦顯微鏡(Olympus IX81，日本)，冰凍切片機(Leica，德國)，Eppendorf5424型離心機(Eppendorf，德國)，-80℃冰箱(Thermo，美國)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和取材 選用12月齡的Wistar大鼠適應性飼養1 w后隨機分為青年對照組(YC組)、自然衰老組(NA組，灌胃等量的蒸餾水)、SWY1組和SWY2組，每組15只。分別在飼養到16、17月齡后，采用何首烏飲(4.8 g/100 g)，灌胃60 d(SWY1組)、30 d(SWY2組)。去除患腫瘤等疾病的大鼠，最終每組取10只大鼠進入結果分析。大鼠斷頭處死，取一側睪丸用4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脫水后，-80℃保存，用于制備冰凍切片；另一側睪丸組織先放液氮中，幾分鐘后再放入-80℃保存，用于進行流式檢測。

1.2.2 中藥復方劑的配制 SWY方劑：由何首烏、肉蓯蓉、懷牛膝、淫羊霍、丹參、茯苓剪碎按質量比3∶2∶3∶2∶5∶3剪碎混合，加8倍量蒸餾水浸泡1 h，然后文火水煎2次，每次30 min，過濾后濃縮至含生藥分別為4.8 g/ml，4℃ 保存，給藥前復溫至25℃～30℃。給藥量：按照成人劑量換算，SWY熬制后含生藥2.4 g/100 g相當于成人用藥量，根據前期研究結果選用成人量2倍療效最佳，因而采用含生藥4.8 g/100 g作為給藥濃度。0.4 ml/100 g灌胃，每天15∶00灌胃1次，連續灌胃60 d或30 d。

1.2.3 原位末端標記法檢測睪丸組織細胞凋亡率 冰凍切片平衡至室溫，PBS洗滌3次，每次10 min；0.5% TritonX-100室溫通透20 min；PBS洗滌3次，每次10 min；每個切片加約30 μl Equilibration Buffer室溫反應10 min；加入染色工作液，37℃避光孵育1 h；加入2倍SCC室溫反應15 min；PBS洗滌3次，每次10 min；DAPI室溫染核20 min,PBS洗滌3次，每次10 min；待片子晾干后用專用熒光封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。每組選取3只大鼠的一側睪丸組織進行切片，每張切片隨機選取10個高倍視野(×400)，計數500個細胞中的陽性細胞數，求得陽性細胞率。

1.2.4 流式細胞術檢測生精細胞中DNA含量 取冰凍組織適量，42℃復溫，去除白膜和脂肪墊，放于培養皿中。向培養皿加入1 ml PBS，用剪刀剪碎，將懸液轉入組織破碎儀的加樣槽內破碎1 min。用5 ml注射器從吸樣孔內吸出細胞懸液，4 000 r/min離心10 min，棄上清。向細胞沉淀中加入1 ml 70%冰乙醇，用移液槍輕輕吹打混勻，4℃固定過夜。取出細胞懸液，4 000 r/min，離心8 min，棄乙醇上清；加入1 ml PBS重懸，4 000 r/min，離心8 min，棄上清，重復2次。向沉淀中加入500 μl PI染色液，4℃下放置30 min，過200目濾網。應用FACS420 型流式細胞儀進行定量分析，數據輸入Consort-30計算機進行處理。細胞的增殖活性以增殖指數(PI)表示,其計算公式為:PI(%)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+S2/M)×100%。

1.3 統計學方法 采用SPSS16.0軟件，符合正態分布的數據均數比較用單因素方差分析(One-Way ANOVA)；若方差齊，兩兩比較采用最小顯著差法(LSD)，如果方差不齊則采用DunnettT3檢驗。

2 結 果

2.1 何首烏飲對細胞凋亡的影響 YC組大鼠睪丸組織細胞凋亡較少見，主要分布在間質細胞。NA組大鼠睪丸組織生精小管內可見大量凋亡的生精細胞且凋亡陽性信號主要分布于精原細胞、精母細胞和精子細胞，偶見于間質細胞。SWY組大鼠的睪丸組織凋亡細胞明顯減少，可見部分精原細胞和間質細胞發生凋亡。半定量分析顯示，NA組大鼠細胞凋亡率〔(14.606 7±0.092 8)%〕明顯高于YC組〔(1.946 7±0.440 1)%〕(P<0.01)；SWY組細胞凋亡率明顯低于NA組(P<0.01),且SWY1組細胞凋亡率〔(8.008 9±0.164 3)%〕明顯低于SWY2組〔(12.959 3±0.317 4)%〕。見圖1。

2.2 何首烏飲對生精細胞周期的影響 圖2所見，YC組睪丸生精細胞以單倍體為主，包括圓形精子以及精子；NA組單倍體和4倍體細胞明顯減少，以二倍體為主；與NA組相比，SWY飲組4倍體和單倍體比例明顯增加(P<0.05)，且與YC組無顯著性差異(P>0.05)。細胞周期結果顯示，與YC組相比，NA組可引起G1/G0期細胞明顯增多(P<0.05)，PI明顯降低(P<0.05)；SWY用藥后，PI明顯升高(P<0.05)，G1/G0期細胞明顯減少(P<0.05)，且SWY1組PI明顯高于SWY 2組。見表2。

圖1 SWY對各組睪丸細胞凋亡的影響

圖2 SWY對大鼠睪丸組織各種倍體細胞所占百分比的影響

組別G1/G0(%)S(%)G2/M(%)PIYC組5064±3422772±3621901±3845205±342NA組8102±4471)892±1471)1006±3361)1898±4471)SWY組6265±1792)1966±5132)1748±4652)3733±1792)

與YC組比較：1)P<0.05；與NA組比較：2)P<0.05

3 討 論

現代研究證實，何首烏具有提高機體免疫力，降血脂，抗動脈粥樣硬化和神經保護作用，具有明顯的抗衰老效果〔4〕。何首烏丸是劉河間《宣明論》的傳統臨床驗方，以何首烏為主藥，配以肉蓯蓉和懷牛膝臨床療效可靠。SWY是由何首烏丸加味而成，其中淫羊藿補腎壯陽以強筋骨，丹參活血化瘀以通心脈，茯苓健脾利濕以寧心神。目前研究結果表明，SWY能提高D-半乳糖所致衰老大鼠的抗氧化能力、改善血脂紊亂狀態，調節性腺細胞衰老通路 p53/pRb 相關蛋白表達〔5,6〕。我們前期研究發現SWY飲能夠提高睪丸間質細胞睪酮合成酶表達，促進睪酮的分泌，提高自然衰老大鼠精子質量〔7〕。SWY可以上調過度訓練大鼠睪丸間質細胞中的 Bcl-2 蛋白表達，下調 Bax 蛋白表達，從而抑制睪丸間質細胞的凋亡，減輕過度訓練對大鼠睪丸間質細胞的損傷〔8〕。

衰老將導致雄性哺乳動物精子生成能力減弱，生精細胞凋亡增加〔2〕，隨著年齡增加，老年小鼠睪丸中部分曲精細管萎縮、基膜增厚，生精阻滯常見于初級精母細胞或精子細胞階段〔9〕；減少最明顯的就是球形精子或延長精子細胞〔10〕，這說明衰老小鼠生精功能改變最先發生在精子發生的后期。Syed 等〔11〕指出老年小鼠支持細胞誘導能力的丟失也是導致生精細胞凋亡的重要原因。細胞凋亡由多位點調控，可以發生在細胞周期的各個階段，常見的有G0/G1期停滯和G2/M期阻滯〔12～14〕。本實驗結果顯示，SWY能明顯降低自然衰老大鼠睪丸細胞凋亡率，提高細胞增殖指數，證明SWY能抑制衰老大鼠生精細胞凋亡，促進細胞增殖，但此種作用機制尚不清楚，有待進一步研究。

1 Shaha C,Tripathi R,Mishra DP.Male germ cell apoptosis:regulation and biology〔J〕.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci,2010;365(1546):1501-15.

2 Jiang H,Zhu WJ,Li J,etal.Quantitative histological analysis and ultrastructure of the aging human testis〔J〕.Int Urol Nephrol,2014;46(5):879-85.

3 曹興午，曹育愛，金合武.生殖細胞凋亡與男性不育癥〔J〕.中國性科學，2004；24(6):3-7.

4 Chik WI,Zhu L,Fan LL,etal.Saussurea involucrata:a review of the botany,phytochemistry and ethnopharmacology of a rare traditional herbal medicine〔J〕.J Ethnopharmacol,2015;172:44-60.

5 李亞麗，郭文潮，余小平，等.何首烏飲對衰老大鼠卵巢增殖與凋亡的影響〔J〕.中國優生和遺傳雜志，2011;19(8)：110-2.

6 郭凱華，高福祿，牛嗣云，等.何首烏飲對衰老大鼠睪丸組織細胞Rb/P53信號轉導通路的影響〔J〕.解剖學報,2010;41(3):435-9.

7 Niu S,Chen J,Duan F,etal.Possible mechanism underlying the effect of Heshouwuyin a tonifying kidney herb,on sperm quality in aging rats〔J〕.BMC Complement Altern Med,2014；14(250):1-14.

8 郭 銀，牛嗣云，高福祿，等.何首烏飲對過度訓練大鼠睪丸間質細胞Bcl-2、Bax 的影響〔J〕.時珍國醫國藥，2012；23(3)：589-90.

9 Chen Y,Wang H,Qi N,etal.Functions of TAM RTKs in regulating spermatogenesis and male fertility in mice〔J〕.Reproduction，2009;138(4):655-66.

10 Nakata H,Wakayama T,Takai Y,etal.Quantitative analysis of the cellular composition in seminiferous tubules in normal and genetically modified infertile mice〔J〕.J Histochem Cytochem,2015;63(2):99-113.

11 Syed V,Hecht NB.Selective loss of Sertoli cell and germ cell function leads to a disruption in sertoli cell-germ cell communication during aging in the Brown Norway rat〔J〕.Biol Reprod,2001;64(1):107-12.

12 Sun J,Fu X,Wang Y,etal.Erianin inhibits the proliferation of T47D cells by inhibiting cell cycles,inducing apoptosis and suppressing migration〔J〕.Am J Transl Res,2016;8(7):3077-86.

13 Su JN,Zhou XX,Wang LX,etal.Curcumin inhibits cell growth and invasion and induces apoptosis through down-regulation of Skp2 in pancreatic cancer cells〔J〕.Am J Cancer Res,2016;6(9):1949-62.

14 Hrgovic I,Doll M,Kleemann J,etal.The histone deacetylase inhibitor trichostatin a decreases lymphangiogenesis by inducing apoptosis and cell cycle arrest via p21-dependent pathways〔J〕.BMC Cancer,2016;16:763.

〔2016-10-25修回〕

(編輯 郭 菁)

The effects of Heshouwuyin on germ cell apoptosis in natural aging rats

WANG Jian-Ming,HUI Chen-Hong,LIU Hao-Kun,etal.

Department of Tissue and Embryo,School of Medicine,Hebei University,Baoding 071000,Hebei,China

Objective To investigate the effects of Heshouwuyin on testicular germ cells apoptosis in natural aging rats.Methods 18-month-old Wistar rats were served as a model of natural aging and 12-month-old rats were as a young control group.Heshouwuyin group 1 and group 2 were given Heshouwuyin intragastrically for 60 days and 30 days respectively.In situ end labeling and flow cytometry methods were selected to detect the rate of apoptosis detection and the amount of DNA in testicular cells.Results The rate of testicular cell apoptosis was obviously higher in natural aging group and that intervention with Heshouwuyin reversed this phenomenon(P<0.05).The spermatogenic cells in natural aging group were mainly diploid and the numbers of haploid and tetraploid were significantly lower,but the rate of haploid and tetraploid was significantly higher in Heshouwuyin group than that in nature aging group(P<0.05).Compared with that of young control group，the number of cells in G1/G0cycle arrest was significantly higher in natural aging group (P<0.05),and the cell proliferation index was significantly lower in natural aging group (P<0.05).Heshouwuyin administration reversed this phenomenon.Conclusions Heshouwuyin could inhibit testicular cells apoptosis,promote cell proliferation,reach the effects of anti-aging,but its mechanism of action remains to be further researched.

Heshouwuyin; Testis tissue; Cell apoptosis; Aging

國家自然科學基金面上項目(81373787)；河北省自然科學基金面上項目(H2013201139)

牛嗣云(1967-)，女，教授，博士，碩士生導師，主要從事生殖藥理學的研究。

王建明(1969-)，男，副教授，主要從事生殖藥理學的研究。

R34

A

1005-9202(2017)02-0266-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.003

1 河北民族師范學院 2 中國人民解放軍軍事交通學院九連