人PETA-3/CD151基因RNAi慢病毒載體的構建及沉默效應鑒定

王紹清 王俊平 徐鳳琳 艾中偉 劉 婷

(齊齊哈爾醫學院病理學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

人PETA-3/CD151基因RNAi慢病毒載體的構建及沉默效應鑒定

王紹清 王俊平 徐鳳琳 艾中偉 劉 婷

(齊齊哈爾醫學院病理學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的 構建PETA-3/CD151shRNA慢病毒表達載體,并在人乳腺癌細胞株MCF-7細胞鑒定其轉染及基因沉默效果。方法 應用基因工程技術，構建4條針對PETA-3基因的RNAi靶序列，分別與慢病毒載體PgLV3連接，構建重組慢病毒表達載體PETA-3-shRNA-1～4；將連接產物轉化到Top10感受態細胞，經篩選陽性克隆、測序鑒定。應用脂質體法轉染293FT細胞，進行病毒包裝及滴度測定。將包裝產生的4種重組慢病毒分別感染MCF-7細胞，實時定量PCR和Western印跡檢測MCF-7細胞PETA-3 mRNA和蛋白的表達。根據篩選的結果，選取最有效的載體進行病毒的大量包裝。結果 4個慢病毒載體PCR和測序結果與預期結果一致，感染MCF-7細胞96 h后，PETA-3-shRNA-2 mRNA和蛋白的表達量與未感染慢病毒的細胞組及空載體感染組相比均明顯下降，其中mRNA表達下降85%，蛋白表達下降84%(均P<0.05)。shRNA-2病毒載體大量包裝后其滴度為1×109TU/ml。結論 成功構建針對PETA-3基因的慢病毒載體PETA-3-RNAi-LV3，體外感染MCF-7細胞后可有效抑制PETA-3基因和蛋白的表達。

PETA-3/CD151；RNA干擾；慢病毒；乳腺癌

四次跨膜結構家族(TM4SF)是抑癌基因家族。它參與其他細胞表面分子之間的連接信號傳導，在調節細胞增殖和激活，調節細胞黏附活力中起重要作用。該家族已檢測有20多個成員，包括MRP-1/CD9、TAPA-1/CD81、ME91/CD63及KAI1/CD82等。KAI1/CD82等已被認為是抑癌基因產物，與腫瘤進展、預后呈負相關〔1～3〕。而PETA-3/CD151作為TM4SF中新近發現的成員，被認為是TM4SF中的癌基因，能與其他跨膜四蛋白超家族成員和(或)整合素等結合形成復合體,通過蛋白激酶C、磷脂酰肌醇4激酶等信號通路將胞外信號轉導入胞內,從而介導細胞的黏附、遷移及血管形成,促進腫瘤細胞侵襲和轉移，與腫瘤進展及預后呈正相關〔4,5〕。慢病毒載體(LV)是以人類免疫缺陷型病毒(HIV)為基礎發展起來的基因治療載體，可感染非分裂細胞和分裂細胞，轉移較大基因片段，抑制目的基因時間較長，不易引發宿主免疫反應〔6,7〕，因具有以上諸多優點，已成為研究RNA干擾(RNAi)的首選技術，本實驗通過構建PETA-3/CD151基因的小發夾RNA(shRNA)LV并進行鑒定,為進一步研究PETA-3/CD151在乳腺癌的作用提供可行的工具，為后期體內作用機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質粒，三種輔助包裝載體質粒(上海吉瑪制藥有限公司)、大腸桿菌感受態Top10、Lentivirus-NC病毒液和凝聚胺(polybrene)，DNA 限制性內切酶(BamHⅠ、EcoRⅠ)、 DNA 連接酶(MBI Fermentas)，Plasmid抽提試劑盒(Promega公司)，293FT 和MCF-7細胞(為本實驗室保存的細胞株)。RNA抽提試劑RNAiso和SYBR ExScriptTMRT-PCR試劑盒(Perfect Real Time，Takara公司)；RMPI1640培養液、胰蛋白酶、胎牛血清(Gibco公司);鼠抗人CD151單克隆抗體(美國Santa cruz公司)。寡核苷酸及引物均由上海吉瑪制藥有限公司合成。主要設備有2700型PCR System擴增儀，ABI 7300熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)，蛋白電泳轉膜裝置，ECL成像系統(BIO-RAD公司)。

1.2 寡核苷酸的設計及表達及shRNA的LV構建 檢索Genebank，獲取PETA-3 基因核苷酸序列，根據以人PETA-3的mRNA序列(GenBank:NM-139029)為模板選擇4段靶序列并設計1段陰性對照序列，經BLAST表明其所設計的序列不與任何其他人類cDNA 序列同源。根據以上5段序列設計5對寡核苷酸序列，每對包含1條正義鏈和1條反義鏈，見表1。PgLV3-shRNA 模板中的loop 結構選用了TTCAAGAGA以避免形成終止信號。正義鏈模板的5′端添加了GATCC，與BamHⅠ酶切后形成的黏端互補;反義鏈模板的5′端添加了AATTC，與EcoRⅠ酶切后形成的黏端互補。根據確定的PETA-3基因RNAi有效序列sh-PETA-3及對照序列sh-Control，化學合成對應的寡核苷酸DNA單鏈，退火形成黏性末端的DNA雙鏈，運用基因克隆技術，與經雙酶切后的穿梭質粒連接。將鏈接產物轉入制備好的大腸桿菌感受態細胞，經含氨芐青霉素培養基篩選后，挑取單菌落擴大培養，手工抽提質粒，由于LV3-shRNA載體中含有EcoRⅠ、BamHⅠ酶切位點，故重組載體可經EcoRⅠ及BamHⅠ雙酶切來初步鑒定，通過DNA測序進一步鑒定。

1.3 PETA-3-siRNA慢病毒包裝與滴度檢測 取細胞狀態良好，處于對數生長期的293FT細胞，細胞計數后，將5×106個細胞接種于10 cm培養皿中，制備DNA-Lipofectamine 2000復合物，共轉染293FT細胞，轉染24 h后更換新鮮培養液，放置37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中繼續培養；于轉染后48、72 h，分別收集培養上清進行濃縮；3 000 r/min 低速離心15 min，用0.45 μm濾器過濾上清液，徹底去除細胞碎片；高速離心90 min，沉淀病毒顆粒，棄去上清，保存病毒原液。采用倍比稀釋法感染293FT細胞，培養72 h后通過倒置熒光顯微鏡計數熒光細胞數，計算病毒滴度。

表1 CD151基因短發卡干擾寡核苷酸片段

1.4 慢病毒浸染靶細胞 細胞分為空載體組(為未攜帶目的基因的慢病毒轉導的MCF-7細胞),對照組(未經轉導的MCF-7細胞正常組)及PETA-3慢病毒組。將MCF-7細胞按1×105/孔的濃度接種于6孔板，放置37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養，24 h后；開始病毒浸染，按MOI 5，10，20，50 感染細胞，加入終濃度為5 μg/ml的凝聚胺，并設立空白對照組。24 h后更換完全培養基，72 h 后用熒光倒置顯微鏡觀察熒光表達情況。

1.5 實時熒光定量PCR檢測靶細胞中PETA-3 mRNA的表達 在病毒感染后的96 h，分別取各組細胞，用Trizol抽提細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，使用SYBR Green熒光定量PCR試劑完成實時熒光定量PCR檢測。每次實驗每個樣本做3個復孔，實驗重復3次。引物序列：β-actin:正義鏈5′-CCCTGGCACCCAGCAC-3′,反義鏈5′-GCCGATCCACACGGAGTAC-3′,PETA-3:正義鏈5′-GACCATGCCTCCAACATCTACAAG-3′,反義鏈5′-GGTGCTCCTGGATGAAGGTCTC-3′。

1.6 Western 印跡檢測靶細胞中PETA-3蛋白的表達 病毒感染后72、96 h，分別提取各組細胞的總蛋白并測定蛋白質濃度。取相同質量的蛋白樣品上樣，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，并轉移至甲醇浸泡過的PVDF膜上，用封閉液封閉轉印膜2 h，TBST洗滌3次，孵育一抗二抗，采用SuperSignal West Pico Chemiluminent Substrates進行化學發光檢測，并對X線光片曝光。經顯影定影處理后，膠片用凝膠成像分析系統拍照，使用Gel-Pro Analyzer軟件分析處理。

1.7 統計學方法 采用SPSS17.0統計學分析軟件進行t檢驗或方差分析。

2 結 果

2.1 慢病毒shRNA 表達載體的鑒定 PETA-3基因shRNA 的寡核苷酸序列與慢病毒骨架質粒連接，將產物轉化入大腸桿菌Top10，挑取重組陽性克隆進行BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鑒定及DNA測序。測序結果顯示重組克隆中插入片段的序列正確。見圖1。

2.2 慢病毒的包裝、滴度測定及最適MOI的確定 293FT細胞經慢病毒轉染72 h后，用倒置熒光顯微鏡觀測細胞中綠色熒光的表達，細胞轉染效率達到90%。病毒經濃縮后，滴度測定為1.0×109TU/ml。篩選最適MOI 為10，轉染效率90%，當MOI>10 時，其轉染效率無明顯提高。見圖2。

2.3 實時熒光定量PCR檢測MCF-7細胞中PETA-3基因mRNA表達情況 用針對各靶點的慢病毒(shRNA-1～4)載體感染MCF-7細胞，見圖3。感染72 h后用熒光顯微鏡觀察GFP的表達，結果顯示感染效率均>90%，感染后96 h收集細胞進行熒光定量PCR檢測。與對照組比較，shRNA-1組，shRNA-2組和shRNA-4組人乳腺癌細胞株MCF-7中PETA-3 mRNA 的表達均明顯下降(均P=0.000),空載體組和對照組比較，PETA-3 mRNA 的表達無明顯差異(P=0.342)，見表2。

2.4 Western印跡檢測MCF-7細胞中PETA-3蛋白表達情況 與空載體組比較，shRNA-2組和shRNA-4組人乳腺癌細胞株MCF-7中PETA-3 蛋白的表達均明顯下降(均P=0.000),空載體組和對照組比較，PETA-3蛋白的表達無明顯差異(P=0.063)，見表2，圖4。

圖1 慢病毒shRNA表達載體的鑒定

圖2 慢病毒感染293FT細胞后熒光影像(×100)

圖3 慢病毒感染MCF-7乳腺癌細胞3 d熒光影像(×100)

組別PETA?3mRNA均值CD151/GAPDH均值空載體組100±013100±002對照組094±012094±006shRNA?1009±0011)2)092±002shRNA?2015±0021)2)016±0051)2)shRNA?3138±0021)2)225±0021)2)shRNA?4025±0031)2)029±0021)2)F/P值158982/00001285683/0000

與空載體組比較：1)P=0.000；與對照組比較：2)P=0.000

1～6：空載體組、對照組、shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3、shRNA-4圖4 Western印跡檢測各組PETA-3蛋白的表達

2.5 病毒大量包裝后滴度測定 根據實時熒光定量PCR和Western 印跡測定的結果，選取最有效的一個RNAi慢病毒表達載體即B病毒進行大量包裝后，測得病毒滴度為1×109TU/ml。

3 討 論

RNAi是后基因組時代功能基因組學研究的強有力工具，是雙鏈RNA 引發的轉錄后基因沉默,通過shRNA或21～23nts 的雙鏈RNA與特異mRNA 結合導致靶基因降解,從而引起目的基因產物表達下調。LV是在HIV-Ⅰ病毒基礎上改造成的病毒載體系統,能高效地將目的基因導入動物和人的原代細胞或細胞系，整合目的基因到宿主細胞基因組中,有效感染并整合非分裂細胞，其干擾作用效率高、持續且穩定,不易誘發宿主免疫反應，適于體內基因治療。LV介導的RNAi已經成為多數研究者的首選〔8～10〕。

PETA-3/CD151與多種惡性腫瘤的發生、發展、轉移、預后及多種基因的突變、細胞信號傳導通路和新生血管增生異常等密切相關，對多種惡性腫瘤的診斷及治療有重要的臨床意義和價值〔11～14〕。本研究設計了4個靶序列，基因測序證明插入片

段的序列大小、方向均與設計的一致，經慢病毒包裝系統包裝后，測定得到高滴度LV，從對靶細胞MCF-7 mRNA和蛋白水平上的表達檢測結果來看，PETA-3-RNAi-LV3-B的效果最好，說明基因靶點篩選構建的有效性和特異性，為今后進一步進行PETA-3體內外研究奠定了基礎。

1 Sincock PM,Mayrhofer G,Ashman LK，etal.Ashman localization of the transmembrane 4 superfamily (TM4SF)member PETA-3 (CD151)in normal human tissues:comparison with CD9,CD63,and 5β1 integrin〔J〕.J Histochem Cytochem，1997;45(4):515-25.

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〔2015-04-11修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

黑龍江省教育廳基金資助(No.11511453；12521626 12531782)

劉 婷(1972-)，女，副教授，博士，主要從事乳腺癌浸潤轉移機制的研究。

王紹清(1978-)，女，講師，博士，主要從事乳腺癌浸潤轉移機制的研究。

R73

A

1005-9202(2017)02-0271-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.005