香連片預防小鼠潰瘍性結腸炎癌變的作用及機制

董躍濱 尚精娟

(上海市第七人民醫院消化科，上海 200137)

香連片預防小鼠潰瘍性結腸炎癌變的作用及機制

董躍濱 尚精娟

(上海市第七人民醫院消化科，上海 200137)

目的 探討香連片在小鼠潰瘍性結腸炎(UC)癌變預防中的作用機制。方法 將60只小鼠隨機分為空白組、模型組、香連片組和柳氮磺胺嘧啶組，每組15只，采用1，2-二甲基肼(DMH)/葡萄聚糖硫酸鈉(DSS)復合法誘導小鼠UC癌變模型。采用逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法檢測DKK-1和WTF-1 mRNA的表達，采用免疫組化法檢測β-鏈蛋白(β-catenin)和增殖細胞核抗原(PCNA)蛋白的表達。結果 與空白組比較，其余各組β-catenin及PANA蛋白表達均升高(P<0.05)；與模型組比較，香連組和對照組β-catenin和PANA蛋白表達均降低(P<0.05)；香連組和對照組β-catenin和PANA蛋白表達無統計學意義(P>0.05)。與空白組比較，模型組DKK-1 mRNA表達降低，香連組和對照組表達升高，其他各組WTF-1 mRNA均表達升高(P<0.05)；與模型組比較，香連組和對照組DKK-1和WTF-1 mRNA表達均升高(P<0.05)；香連組和對照組DKK-1和WTF-1 mRNA表達無統計學意義(P>0.05)。結論 香連片可以通過抑制β-catenin和PANA蛋白表達、提高DKK-1和WTF-1 mRNA表達阻斷Wnt通路，發揮預防UC癌變的作用。

潰瘍性結腸炎；癌變；香連片

研究表明，香連片具有抗菌、抗胃腸炎、抗潰瘍性結腸炎(UC)等藥理作用〔1〕。據報道，約5%的UC患者在疾病進展過程中發生癌變，其癌變機制尚不明確，但研究發現與患者病程、嚴重程度和復發率密切相關〔2〕。Wnt信號通路在結直腸癌的發病過程中發揮重要作用。β-鏈蛋白(β-catenin)在Wnt通路中發揮正向調節效應，核內β-catenin水平的升高能夠激活下游效應基本的轉錄過程，是Wnt信號通路的激活標識，參與結直腸癌的進展〔3〕。β-catenin已經作為結腸癌進展的常見標志物。DKK-1是一種外泌型的糖蛋白，在Wnt信號通路中發揮拮抗作用，能夠特異性的抑制Wnt信號通路〔4〕。本研究擬構建UC癌變小鼠模型，從分子生物學水平上探討香連片在UC癌變預防中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及分組 選擇60只7～8 w BALB/C雄性小鼠，體重(21.21±3.11)g，由上海義森生物科技有限公司提供。將60只小鼠隨機分成空白組、模型組、香連片組和柳氮磺胺嘧啶對照組，每組15只。

1.2 實驗試劑及器材 香連片：0.3 g/片，國藥準字Z10900035，購自湖北香連藥業有限責任公司；柳氮磺胺嘧啶，0.25 g/片，國藥準字H31020450，購自上海中西三維藥業有限公司。葡萄聚糖硫酸鈉(DSS)(分子量50 kD)購自Fluka公司，1，2-二甲基肼(DMH)購自Sigma公司。小鼠β-catenin、β-catin、DKK-1引物均購自上海生工生物工程技術服務有限公司，增殖細胞核抗原(PCNA)一抗購自Abcam生物工程有限公司；Trizol購自Superior公司；ABI熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；Elx800NB酶標儀購自美國BioTek公司。

1.3 動物模型 空白組給予生理鹽水作為對照，不做其他處理。模型組采用腹腔注射DMH結合飲用DSS法制備UC癌變模型。實驗小鼠腹腔注射20 mg/kg DMH，2次/w，在各造模組小鼠飲用生理鹽水中添加5%DSS，2 w，以上整個流程(共3 w)為1個循環，重復以上過程3個循環。從第10周開始不做處理，持續至第18周。香連組：將香連片溶解在蒸餾水中，用藥濃度13.5 mg/ml，自造模前1 w開始用藥，至造模第10周。對照組：將柳氮磺胺嘧啶溶解在蒸餾水中，用藥濃度7.5 mg/ml，自造模前1 w開始用藥，至造模第10周。

1.4 檢測DKK-1和WTF-1 mRNA的表達 采用逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術對腸組織中DKK-1和WTF-1 mRNA的表達進行半定量測量。取新鮮的病變腸組織和正常腸組織分別提取RNA，操作過程嚴格按照RNA提取試劑盒的操作說明進行。采用Biotek酶標儀檢測RNA濃度，按照反轉錄試劑盒說明書反轉錄成cDNA，PCR儀反應程序：95℃下變性30 s，60℃下退火30 s，循環40次。DKK-1引物序列：上游序列5′-GACTCTTGACAACTACCAGC-3′，下游序列5′-AAATGGCTGTGGTCAGAGGG-3′；WTF-1引物序列：上游序列5′-TGTATGAACGGTGGTCTGTG-3′，下游序列5′-ATTTACCTCCATTTCGGGAG-3′。

1.5 檢測β-catenin和PCNA蛋白表達 采用免疫組化法檢測β-catenin和PCNA蛋白表達。各組織切片脫蠟至水，100℃加熱，抗原修復；室溫下，過氧化氫-甲醇(3%)封閉20 min；牛血清白蛋白溶液(5%)封閉30 min。滴加1∶500的β-catenin一抗和1∶250的PANA一抗，4℃搖床過夜，加二抗，常溫孵育30 min。二氨基聯苯胺(DAB)染色液顯色，控制顯色時間在10 min；根據陽性染色位置調整復染、脫水、透明、封片。

1.6 蛋白表達結果判定 當細胞膜、細胞質或細胞核內出現黃色棕黃色顆粒定義為β-catenin陽性，當細胞核內出現棕黃色顆粒為PCNA陽性。判斷標準：高倍鏡下選擇5個視野，依據陽性細胞的比例及其著色強度計分。(1)陽性細胞數分值為0分(<5%)、1分(5%～25%)、2分(25%～50%)、3分(>50%)；(2)陽性細胞著色強度分值為0分(陰性)、1～2分(弱陽性)、3～5分(中等陽性)、6～7分(強陽性)。

1.7 基因相對表達量判斷 采用ΔΔCT法分析基因的相對表達量，其相對表達量為2-ΔΔCT。ΔΔCT=(觀察樣本ΔCT-對照樣本ΔCT)，T=(觀察樣本目的基因CT-內參基因CT)-(對照樣本目的基因CT-內參基因CT)。

1.8 統計學方法 應用SPSS16.0進行方差分析和LSD法。

2 結 果

2.1 各組β-catenin和PCNA蛋白表達比較 各組間β-catenin和PCNA蛋白表達均有統計學意義(P<0.05)。與空白組比較，其余各組β-catenin及PCNA蛋白表達均升高(P<0.05)；與模型組比較，香連組和對照組均降低(P<0.05)；香連組和對照組β-catenin和PCNA蛋白表達無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 各組DKK-1和WTF-1 mRNA表達比較 各組間DKK-1 mRNA和WTF-1 mRNA表達量均有統計學意義(P<0.05)。與空白組比較，模型組DKK-1 mRNA表達降低，香連組和對照組表達升高，其他各組WTF-1 mRNA均表達升高(P<0.05)；與模型組比較，香連組和對照組DKK-1和WTF-1 mRNA表達均升高(P<0.05)；香連組和對照組無統計學差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組β-catenin、pCNA及DKK-1、WTF-1 mRNA比較

與空白組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

3 討 論

UC病變常累及直腸和結腸，黏膜出現彌漫性炎細胞浸潤，伴有多發性潰瘍。UC癌變的發展經歷著炎癥-增生-癌變的進程〔5〕。目前，UC治療藥物主要有免疫抑制劑、類固醇激素和氨基水楊酸類。氨基水楊酸類常用于中輕型患者，免疫抑制類和激素類常用于重度患者的治療。前期有研究發現，香連片能夠預防UC的癌變進程。Wnt信號通路是一條信號轉到途徑，在許多發育過程和機體組織的動態平衡張發揮重要作用，還參與了干細胞的分化過程〔6〕。其中，Wnt/β-catenin信號通路也被稱為經典Wnt通路，通過調控細胞內的β-catenin，對下游靶基因的表達進行調控〔7〕。首先，由Axin、APC和GSK3β形成磷酸化胞質，被磷酸化和泛素化后，被蛋白酶體降解。當細胞外配體Wnt與細胞膜上的Frizzled受體及LRP5/6受體結合后，激活Wnt信號通路。激活的受體將信號傳遞給細胞質中的蛋白，使得β-catenin降解并積累。大量β-catenin進入細胞核，與LEF/TCF等轉錄因子結合后，激活下游靶基因的調控。在Wnt信號通路的過程中，DKK一方面可以與LRP5/6結合，干擾LRR5/6和Frizzled復合物的結合；另一方面，能夠與Krm受體和LRP6形成復合物，發生內吞現象，細胞膜表面LRP6受體被清楚，抑制Wnt信號〔8〕。WIF-1是一種內源性拮抗劑，在腫瘤發生的過程進程中發揮重要生物學作用。WIF-1能夠與Wnt配體蛋白結合抑制其信號通路〔9〕。

本研究結果說明香連片能夠下調β-catenin蛋白的表達，進而抑制Wnt通路的激活。且香連片能夠上調DDK-1和WTF-1 mRNA的表達，抑制Wnt通路，與殷銀霞等〔10〕、王欣等〔11〕研究一致。綜上所述，香連片可以通過抑制β-catenin和PANA蛋白表達、提高DKK-1和WTF-1 mRNA表達阻斷Wnt通路，發揮預防UC癌變的作用。

1 Yoshioka K，Ueno Y，Tanaka S，etal.Role of natural killer T cells in the mouse colitis-associated colon cancer model〔J〕.Scand J Immunol，2012；75(1)：16-26.

2 段麗文，徐北辰.潰瘍性結腸炎的診治進展〔J〕.遼寧醫學院學報，2012；33(6)：571-4.

3 Li M，Cai H，Yang Y，etal.Perichondrium mesenchymal stem cells inhibit the growth of breast cancer cells via the DKK-1/Wnt/β-catenin signaling pathway〔J〕.Oncol Rep，2016；36(2)：936-44.

4 Kim HY，Park JH，Won HY，etal.CBX7 inhibits breast tumorigenicity through DKK-1-mediated suppression of the Wnt/β-catenin pathway〔J〕.FASEB J，2015；29(1)：300-13.

5 羅鳳燕，白愛平.潰瘍性結腸炎動物模型的研究進展〔J〕.世界華人消化雜志，2013；21(7)：607-13.

6 Yong X，Tang B，Xiao YF，etal.Helicobacter pylori upregulates nanog and oct4 via wnt/β-catenin signaling pathway to promote cancer stem cell-like properties in human gastric cancer〔J〕.Cancer Lett，2016；374(2)：292-303.

7 Hu N，Wang C，Zheng Y，etal.The role of the Wnt/β-catenin-Annexin A1 pathway in the process of sevoflurane-induced cognitive dysfunction〔J〕.J Neurochem，2016；137(2)：240-52.

8 Tiwari SK，Agarwal S，Seth B，etal.Inhibitory effects of bisphenol-a on neural stem cells proliferation and differentiation in the rat brain are dependent on wnt/β-catenin pathway〔J〕.Mol Neurobiol，2015；52(3)：1735-57.

9 段 飛，李書忠，朱萬平，等.轉入WIF-1或5-氮雜-2′-脫氧胞苷去甲基化抑制骨肉瘤模型鼠的腫瘤生長〔J〕.中國組織工程研究，2016；20(27)：3984-91.

10 殷銀霞，許雅清，李海龍，等.IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ在脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎模型大鼠血清及組織中的表達〔J〕.中國實驗動物學報，2015；23(2)：139-42.

11 王 欣，王偉明，宋亞娟，等.香連膠囊對大鼠急性腸炎的作用〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2013；19(3):212-5.

〔2016-10-25修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

董躍濱(1962-)，女，碩士，主任醫師，主要從事潰瘍性結腸炎發病機制的研究。

R574.63

A

1005-9202(2017)02-0297-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.016