舌癌細胞成像中的上轉換發光材料

徐亞娟 陳 蕊 金志巍 張艷秋 劉文書

(吉林省腫瘤醫院口腔頜面腫瘤外科，吉林 長春 130012)

舌癌細胞成像中的上轉換發光材料

徐亞娟 陳 蕊 金志巍 張艷秋 劉文書1

(吉林省腫瘤醫院口腔頜面腫瘤外科，吉林 長春 130012)

目的 探討上轉換發光材料在舌癌細胞成像中的應用價值。方法 采用 MTT 法對上轉換稀土發光納米探針進行細胞毒性分析。將胺基修飾過的上轉換發光納米探針皮下注射到裸鼠腋下腫瘤處，對裸鼠進行 CT 檢測。合成上轉換發光納米分子探針，對其進行表征及胺基修飾，并進行紅外光譜分析。結果 采用水熱法制備得到粒子大小均一的上轉換發光納米材料NaYF4。上轉換納米材料能激發深層生物組織信號，具有很深的激發光穿透能力，避免了對組織、細胞的損傷。它具有的良好生物相容性，較小毒副作用，熒光壽命長，有多個發射峰且發射譜帶窄的特點，有利于進行多重生物組織的標記成像。結論 上轉換發光納米探針能在癌細胞成像，為進一步上轉換發光的納米探針的臨床應用奠定理論基礎。

上轉換發光納米探針；細胞成像；胺基修飾；CT檢測

早期預警對舌癌的診斷及治療至關重要，目前，常用的生物檢測手段有磁共振成像(MRI)、正電子發射計算機、電子計算機、光學成像、CT、PETCT橫斷掃描等，但效果均不理想〔1〕。上轉換發光是一種在近紅外光激發下能發出可見光或紫外光,它可以吸收兩個或兩個以上低能光子而輻射一個高能光子的發光現象〔2〕。無機基質材料的稀土離子上轉換發光材料具有較長的能級壽命、較高的上轉換發光效率，是目前研究較多且比較理想的上轉換材料。經常使用Yb3+離子進行共摻雜可提高其發光率。稀土離子Yb3+的吸收光譜峰值在980 nm，與Er3+第一激發態的吸收能量相一致，且吸收截面遠>Er3+,吸收完能量后可直接傳遞給Er3+，因此是一種很有效的上轉換敏化劑〔3〕。

本研究合成了氨基修飾的納米材料上轉換納米材料，具有優良的 UCL 性質，氨基不僅極大地增強了上轉換發光納米粒子核的熒光強度，還能夠使納米探針更容易與目標細胞結合，形成細胞成像。通過荷腫瘤裸鼠的活體實驗，證明了氨基修飾的上轉換發光納米粒子能在舌癌細胞中成像，為納米探針的臨床應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人舌鱗癌細胞(Tca-8113)、稀土氧化物(氧化釔(Y2O3)、氧化鐿(Yb2O3)，氧化鉺(Er2O3)、氧化釓(Gd2O3)、DMEM、胎兒牛血清蛋白(FBS)、溴化噻唑藍四氮唑(MTT)。其他試劑均為國產分析純試劑。實驗用水為去離子水，除特殊說明外，實驗均在室溫下進行。

1.2 實驗方法

1.2.1 上轉換發光納米粒子的合成 將Y2O3、Yb2O3和Er2O3分別溶于過量的HCl中加熱蒸干，然后再加入適量水配制成1.6 mol/L YCl3，0.1 mol/L ErCl和30.6 mol/L YbCl3的水溶液作為儲備液。接著分別提取0.5 ml YCl3、30.3 ml YbCl3和0.2 L ErCl的儲備液加入到容量為100 ml的三口燒瓶中，攪拌均勻后逐漸加熱升溫至100℃后蒸干水分，再加入6 ml油酸和15 ml 1-十八烯，繼續升溫達到150℃。觀察反應混合物形成均勻的淡黃色溶液后，再冷卻至室溫，并逐滴加入2.5 mmol NaOH 的甲醇溶液10 ml和含有 4 mmol NH4F，均勻攪拌1 h后升溫逐漸達到70℃，然后進一步排盡甲醇，再升溫至100℃，緩慢升溫至300℃。在 300℃下孵育1 h后，再冷卻到室溫。最后以乙醇為洗滌液，在10 000 r/min離心洗滌3次；最后將所獲得的NaYF4∶Yb3+,Er3+納米粒子重新分散于5 ml環己烷中，待用。

1.2.2 上轉換發光納米粒子的胺基修飾方法 將NaYF4納米粒子置于環己烷溶液中，與8 ml鹽酸溶液混合攪拌過夜，去掉納米粒子表面的配體，由-OH配位，加丙酮20 ml，8 000 r/min離心8 min，用水分散加丙酮沉化，11 500 r/min離心20 min，重復2次；加入到配置的750 mg聚丙烯酰胺(PAAM)20 wt%水溶液并分散于50 ml水的水溶液中，攪拌過夜；之后11 500 r/min離心15 min，重復3遍，得到的沉淀分散在8 ml二甲基甲酰胺(DMF)或者水中。

1.2.3 MTT細胞毒性實驗 用含10%FBS DMEM，5% CO2、37℃下培養人舌鱗癌細胞(Tca-8113細胞)。將細胞密度為1×105細胞/孔的Tca-8113細胞懸浮液接種到48孔板中培養，用 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH7.2)清洗細胞3次；分別加入 50 μl(0.31，0.63和1.25 g/L) 不同濃度的NaYF4∶Yb3+，ER3+納米探針和50 μl(0.31、0.63和1.25 g/L) 不同濃度的胺基修飾過的NaYF4∶Yb3+，ER3+納米探針，以及 100 μl新鮮 DMEM共孵育24 h。

1.2.4 CT造影成像實驗 取1 ml(0，0.31，0.63，1.25 和2.50 g/L)不同濃度的胺基修飾的納米探針水溶液分別加入EP離心，利用螺旋CT(GE64排)對納米探針圖像采集(成像參數：Thickness=0.1 mm；Pitch=0.648；120 kVp，192 mA；Field of view=108 $108；Matrix=1 024 $1 024 pixels;Gantry rotation time=0.75 s；Table speed=16.7 mm/s)。

1.2.5 裸鼠的活體 CT 成像 先將150 μl水合氯醛溶液(10%，1∶1) 注入種植有腋下腫瘤的裸鼠，在腫瘤區皮下注射150 μl胺基修飾的納米探針溶液；在不同的時間點對裸鼠進行 CT 成像(成像參數:TR/TE=1 000，2 000，3 000，4 000/7.9 ms;Field of view=8 cm;Matrix=128 $128;number of excitations(NEX)=2;Slice thickness=2 mm;Space=0.5 mm;Coil=QUADKNEE)。

2 結 果

2.1 上轉換發光納米探針的表征 上轉換發光納米粒子在原子力顯微鏡下觀察，納米粒子大小均一，平均粒徑為(240±1.2)nm。如圖1A 所顯示NaYF4∶Yb3+，Er3+納米粒子為球形。胺基修飾之后，納米粒子的粒徑相應的增加到(400±3)nm (如圖1B所示)。

A：未修飾的納米粒子；B：胺基修飾的納米粒子圖1 上轉換發光納米粒原子力顯微鏡圖

2.2 紅外光譜對上轉換發光納米探針檢測 對上轉換發光納米探針進行胺基修飾，為檢測納米探針胺基的存在，通過紅外光譜對此法合成的胺基修飾前后的NaYF4納米粒子進行表征。油相制備的NaYF4∶Yb3+,Er3+納米粒子譜線中2 754 cm-1和2 853 cm-1來自于C-H鍵的伸縮振動，利用PAAM(聚丙烯胺)相轉移之后的樣品中，同時1 157 cm-1的吸收峰來自C-H的伸縮振動，而1 472 cm-1和1 659 cm-1的吸收峰來自N-H的變形振動，出現這些新的振動峰足以證實PAAM配體對上轉換納米粒子的修飾是成功的，見圖2。胺基能與含有羧基的生物分子(如抗體，蛋白、氨基修飾等)反應，為納米探針的進一步生物應用，如藥物負載、癌癥的靶向治療等提供可能性。

用980 nm波長的激光照射分散在血清細胞生長培養基的胺基修飾過的納米探針，在暗室內，能觀察到穩定均一的光束。實驗表明胺基修飾的上轉換發光納米探針在DMEM細胞培基中具有良好的分散性和穩定性。

2.3 上轉換發光納米探針的細胞毒性檢測實驗 利用體外細胞毒性實驗對納米探針進行細胞毒性檢測，評價上轉換發光納米探針的在接觸細胞后所產生的生物學反應。實驗設立了三組濃度梯度，通過MTT實驗檢測細胞的成活數(圖3)。在三組實驗濃度下Tca-8113存活率都在90%以上(見表1)。

圖2 胺基修飾的上轉換發光納米粒的紅外光譜圖

圖3 MTT細胞毒性實驗數據

利用獲得OD值計算三組實驗濃度下Tca-8113存活率都在90%以上(見表1)。Tca-8113與濃度高達 2.5 g/L 的上轉換發光納米探針共培養24 h后仍保持高于90%的存活率，說明納米探針具有較低的細胞毒性。實驗結果表明：不同濃度梯度的納米探針NaYF4∶Yb3+,Er3+,和胺基修飾過的NaYF4∶Yb3+,Er3+納米探針，對細胞的毒性都很小。

2.4 上轉換發光納米探針的磁共振特性檢測 為了驗證胺基修飾過的上轉換發光納米探針是否具有磁共振(MR)特性能，并夠提高 MRI的造影效果。以及胺基修飾的上轉換發光納米探針是否具能在細胞內成像，利用GE64排螺旋CT系統對納米探針進行CT圖像采集，檢測合成的探針在CT造影的穩定性。實驗結果表明在kOe(1 Oe=41π103 A/m)的磁場下，胺基修飾的NaYF4∶Yb3+,Er3+納米探針具有CT信號，且CT信號與納米探針的濃度成正比。實驗將10 g/L胺基修飾過的上轉換發光納米探針皮下注射到裸鼠腋下腫瘤處；分別在注射前和注射后30 min對裸鼠進行CT 檢測，觀察發現納米探針對腫瘤區的信號有明顯的增強效果。在注射納米探針前腫瘤區的CT 信號值為42，而注射30 min后腫瘤區明顯變亮(見圖4)，其CT信號值增加到314，證明胺基修飾過的上轉換發光納米探針具有較強的 CT 造影能力。實驗結果表明：胺基修飾過的上轉換發光納米探針能夠作為納米探針應用于CT活體成像。

表1 不同濃度梯度的細胞活性

1：未注射上轉換發光納米探針圖像；2：注射胺基修飾過的上轉換發光納米探針30 min 后圖像圖4 下腫瘤的裸鼠進行 CT成像

3 討 論

上轉換發光材料在生物成像方面具有巨大優勢，這種材料具有很強的熒光效率，比較理想的光穩定性和抗漂白性，和非常完美的性價比。上轉納米材料通常以近紅外光(一般為980 nm)為激發光源，這使得它具有很強的穿透能力，對組織的損傷較輕而且組織不會產生自發熒光。這些優點使上轉換發光納米材料成為繼量子點后，又一應用性強熒光探針〔4〕。同時上轉換稀土納米材料也是一種理想應用方向的納米造影劑，如果摻雜了適當的稀土元素，能使其具備上轉換熒光(UCL)的特性和 CT造影的能力。采用980 nm 成像技術、近紅外激光激發的UCL，更具有強的穿透力且無任何干擾、背景低等優點，能從紫外區跨度到紅外區，使成像的選擇能力有所提高〔5〕。1999年Zijlmans等在首次報道了上轉換熒光材料檢測人類前列腺組織中特異性抗原，使得上轉換納米材料廣泛應用于各種生物檢測和分析〔6〕。有研究報道了一種新穎的上轉換納米材料檢測方法，用Yb3+，Er3+一同摻雜到上轉換納米顆粒做成生物探針對溶液中痕量進行分析和檢測〔7〕。

上轉換納米稀土發光材料(UCNPs)是可發出反斯托克斯光、將光子能量轉換升高同時也可將近紅外光轉換成可見光的功能性材料〔8〕，其最大特點是在能量上吸收光要遠小于發射光〔9〕。本論文采用水熱法制備得到粒子大小均一的上轉換發光納米材料NaYF4，對上轉換發光納米探針進行胺基修飾，為檢測納米探針胺基的存在，通過紅外光譜對此法合成的胺基修飾的NaYF4納米粒子進行表征，通過胺基與含羧基的生物分子反應為納米探針的進一步生物應用提供可能性。雖然有文章報道了 UCNPs 在細胞水平有限的毒性〔10〕，但是在合成上轉換納米稀土發光納米探針避開了有毒的成分，并通過MTT法進行細胞毒性檢測，沒有觀察到有明顯的抑制生長的現象。同時運用上轉換稀土發光材料對裸鼠進行 CT 檢測，證實納米探針具有識別舌癌細胞區的信號效果。綜上，實驗證實上轉換發光納米材料在生物診療方面獨特的性質和優勢，具有良好相容性，能夠作為一種舌癌腫瘤標記、追蹤與檢測的材料，在未來的生物醫學腫瘤診治方面有著廣闊的應用價值。

1 高碩輝,柳扶搖,張卜天,等.NaYF4∶Yb3+,Er3+@NaGdF4@TaOx多模態納米探針的合成及其在生物成像中的應用〔J〕.分析化學，2013；41(6)：811-6.

2 姜桂鋮.稀土摻雜光譜轉換材料及其生物熒光探針應用〔D〕.合肥：中國科學技術大學，2012.

3 張向華,李 立,龔軍輝,等.CaO對提高Er3+/Yb3+共摻ZrO2上轉換發光效率的研究〔J〕.硅酸鹽通報,2011;30(6):1386-409.

4 馬玉潤.Yb,Er摻雜的NaYF4上轉換納米材料的制備和發光性能的研究〔D〕.上海：上海師范大學,2015.

5 劉 波，胡 丹，劉玉萍，等.上轉換發光納米材料在生物成像中應用的研究進展〔J〕.科學通報,2013;58(7):517-23.

6 周 進.功能化碳納米材料的制備及其熒光性能研究〔D〕.杭州：浙江師范大學,2013.

7 馬小媛,李 雙,吳世嘉,等.基于上轉換熒光標記和磁分離技術的沙門氏菌DNA檢測新方法〔J〕.食品與生物技術學報,2013;32(12):1303-10.

8 汪 超.稀土上轉換發光納米材料在腫瘤治療與生物影像檢測方面的應用〔D〕.蘇州：蘇州大學,2014.

9 胡 鶴.稀土上轉換發光納米材料的制備及其在生物醫學成像中的應用〔D〕.上海：復旦大學,2009.

10 宋 凱,杜 創,趙軍偉,等.NaYF_4:Yb～(3+),Er～(3+)發光上轉換納米晶的表面修飾及其生物效應〔J〕.發光學報,2012;33(11):1215-8.

〔2015-12-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

劉文書(1966-)，男，教授，碩士生導師，主要從事口腔頜面外科臨床研究。

徐亞娟(1965-)，女，主任醫師，主要從事口腔頜面腫瘤研究。

R73

A

1005-9202(2017)02-0301-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.018

1 吉林大學第一臨床醫院口腔科