miR-125b靶向Smad4調控非創傷性股骨頭壞死骨髓基質干細胞成骨分化與增殖的相關性

李 鈞 童 哲 魏 勇 舒正華 王西迅

(嘉興市武警醫院骨三科，浙江 嘉興 314000)

miR-125b靶向Smad4調控非創傷性股骨頭壞死骨髓基質干細胞成骨分化與增殖的相關性

李 鈞 童 哲 魏 勇 舒正華 王西迅

(嘉興市武警醫院骨三科，浙江 嘉興 314000)

目的 探討miR-125靶向Smad4調控對非創傷性股骨頭壞死骨髓基質干細胞成骨分化與增殖的影響。方法 培養人骨髓基質干細胞系HMSC-bm，將miR-125b 模擬物(mimics)、miR-125b 抑制物(inhibitor)和對照(miR-NC)轉染到細胞內，qRT-PCR和Western印跡檢測過表達對Smad4表達的影響，構建野生型和突變型的Smad4的3′-UTR熒光素酶報告載體，分別命名為Wt-Smad4和Mut-Smad4，將構建好的質粒做三組共轉染，即Wt-Smad4與miR-125b mimics、Mut-Smad4和miR-125b mimics以及 miR-NC與miR-125b mimics，檢測熒光素酶的活性；BMP-2誘導HMSC-bm分化，將miR-125b mimics和si-Smad4轉染到分化的細胞內，以不轉染的細胞作為參照，檢測miR-125b靶向Smad4對細胞分化的影響；將miR-125b mimics、miR-125b inhibitor和miR-NC轉染到對數生長期的HMSC-bm細胞系，膽囊收縮素(CCK)8檢測過表達對細胞增殖的影響；將miR-125b mimics與pcDNA3.1-Smad4質粒共轉染；miR-125b mimics；miR-NC組；miR-NC與pcDNA3.1-Smad4組轉染到HMSC-bm細胞系，檢測miR-125b靶向Smad4對細胞增殖和分化的影響。結果 轉染 miR-125b mimics組Smad4的相對表達量顯著低于miR-125b NC組，轉染miR-125b inhibitor組Smad4的相對表達量顯著高于miR-125b NC組(P<0.01)，Western印跡的檢測結果與其一致，熒光素酶結果顯示，Wt-Smad4與miR-125b mimics組熒光素酶活性顯著低于miR-NC與miR-125b mimics組(P<0.01)，結果證實Smad4是miR-125b的靶基因；miR-125b mimics和si-Smad4 組Runx2和Osterix mRNA表達量顯著低于對照組(P<0.01)；CCK8檢測結果顯示，miR-125b mimics組在24 h、48 h、72 h 3個時間點細胞的增殖率顯著高于對照組(P<0.01)，miR-125b inhibitor 組在3個時間點的細胞增殖率顯著低于對照組(P<0.01)；miR-125b靶向Smad4對細胞增殖分化的影響試驗結果顯示，miR-125b mimics組細胞增殖顯著高于miR-NC組(P<0.01)，miR-125b mimics與pcDNA3.1-Smad4質粒共轉染組細胞增殖顯著高于miR-NC(P<0.05)，miR-NC與pcDNA3.1-Smad4組細胞增殖顯著低于miR-NC組(P<0.05)，miR-125b mimics組和miR-125b mimics+pcDNA3.1-Smad4組細胞中Runx2和Osterix的mRNA相對表達量顯著高于miR-NC組(P<0.01)；miR-NC+pcDNA3.1-Smad4組細胞中Runx2和Osterix的mRNA相對表達量顯著低于miR-NC組(P<0.01)。結論 Smad4是miR-125b的靶基因，上調miR-125b促進細胞增殖，下調miR-125b減弱細胞增殖，miR-125b靶向Smad4調控HMSC-bm細胞增殖和分化。

miR-125b；Smad4；骨髓基質干細胞；分化；增殖

非創傷性股骨頭壞死一般采用姑息治療。一般患者在4～5年將出現股骨頭的塌陷，需要進行全髖關節置換〔1〕。間充質干細胞(MSCs)是一種成體干細胞，具有多項的分化潛能，可分化成軟骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞等〔2〕。研究顯示，激素誘導的MSCs向脂肪細胞分化，能使股骨頭的壞死加重，當發生股骨頭壞死后，股骨頭、莖、干MSCs增殖和分化能力下降，導致機體進行自身的修復能力下降〔3〕。MiRNAs是一類含有19～25個核苷酸的小分子非編碼RNA，能與靶基因結合從而抑制靶mRNA的翻譯和使靶mRNA降解，達到轉錄后調控的目的〔4〕。研究顯示，miR-125b可參與MSCs成骨的分化，下調miR-125b后，可促進MSCs成骨的分化〔5〕。本研究通過預測miR-125b的靶基因，證實miR-125b靶向調控Smad4對骨髓MSCs分化和增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 DMEM培養基購自美國Gibco，胰蛋白酶均購自美國Sigma；BMP-2購自美國RD公司；SYBR Green購自上海生工生物工程有限公司；雙熒光報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；miR-125b mimics、miR-125b inhibitor、miR-NC購自廣州銳博生物科技有限公司；多功能酶標儀購自美國Thermo公司；實時定量PCR儀購自美國ABI公司；倒置熒光顯微鏡購自日本Nikon公司；細胞培養箱購自美國西盟公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 人MSCs(HMSCs)的分離和培養 從非創傷性股骨頭壞死患者取骨髓2 ml，DMEM培養液等倍稀釋，500 r/min離心10 min，吸掉上清和上層脂肪，再次等倍稀釋后，加入Ficoll淋巴細胞分離液，2 000 r/min離心30 min，收集單個核細胞，洗滌2次，加入含有10 ml的DMEM細胞培養液中，37℃，5%CO2培養箱中培養。3 d后換液，棄去未貼壁細胞，待貼壁細胞長滿瓶底后，用0.25%Trypsin-0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化傳代。

1.2.2 細胞轉染 取對數生長期的HMSC-bm細胞系，加入0.25 %的胰蛋白酶消化細胞，細胞呈單個存在時，轉移到一個新的離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入不含有胎牛血清(FBS)的不完全培養液接種到細胞培養板中，在37℃，5% CO2培養箱中培養。當細胞融合度達到60%時，將miR-125b mimics、miR-125b inhibitor和miR-NC與不完全培養基混合后加入到HMSC-bm細胞，滴加到24孔板表面，37℃，5% CO2培養箱中培養48 h。qRT-PCR及Western印跡檢測Smad4基因表達。

1.2.3 熒光素酶報告基因檢測 通過PicTa、TargetScan、The miRBase三大靶基因預測庫預測miR-125b與Smad4的3′-UTR有結合位點。將含有miR-125b結合位點的Smad4的3′-UTR片段插入PGL-REPORT載體報告基因中，構建野生型和突變型的Smad4的3′-UTR熒光素酶報告載體，分別命名為Wt-Smad4和Mut-Smad4。將構建好的質粒做三組共轉染，即Wt-Smad4與miR-125b mimics、Mut-Smad4和miR-125b mimics以及 miR-NC與miR-125b mimics。37℃，5%CO2的恒溫培養箱中培養24 h后收集細胞，參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測雙熒光素酶活性。

1.2.4 miR-125b對HMSC-bm細胞系分化的影響 取第三代HMSC-bm細胞系，觀察到細胞達到80%融合時，將培養瓶中的細胞用0.25%胰酶消化，接種到3個12孔板中，加入含有10%FBS 的DMEM培養液，37℃，5% CO2培養箱中培養。當3個12孔板中的細胞融合度達到60%時，在15個孔中加入10%FBS 的DMEM+100 ng/ml BMP-2 配制成成骨誘導液作為實驗組，15個孔加入含有10%FBS 的DMEM培養液為陰性對照組。3 d換液1次，細胞生長達到60%～70%時，將miR-NC、miR-125b mimics、si-Smad4、 miR-125b mimics與pcDNA3.1-Smad4質粒共轉染，miR-NC與pcDNA3.1-Smad4組細胞加入含有5 μl脂質體和500 μl無血清培養基中，充分混勻后，室溫靜置40 min，FBS洗滌細胞后，加入1.5 ml不含有抗生素的無血清培養基。轉入6孔板中，37℃，5% CO2培養箱中培養4～6 h，換成完全培養基用于后續的試驗。

1.2.5 miR-125b對HMSC-bm細胞系增殖的影響 取轉染后生長至對數期的miR-125b mimics、miR-125b inhibitor和miR-NC三組細胞，用細胞培養液懸浮細胞，調整細胞濃度為每毫升中含有3×105個細胞，接種于96孔細胞培養板中，每孔加入細胞懸液100 μl，37℃，5% CO2培養箱中培養24、48、72 h后，加入10 μl膽囊收縮素(CCK)8溶液，37℃，5% CO2培養箱孵育2 h，酶標儀在波長為450 nm處測定并記錄各組的吸光度OD。

1.2.6 miR-125b靶向Smad4對細胞增殖的影響 實驗分為四組：一組為miR-125b mimics與pcDNA3.1-Smad4質粒共轉染；一組為miR-125b mimics；一組為miR-NC；一組miR-NC與pcDNA3.1-Smad4。取對數生長期的HMSC-bm細胞系，胰酶消化細胞，轉移到一個新的離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，與不含有FBS的不完全培養液接種到細胞培養板中，在37℃，5% CO2培養箱中培養24、48、72 h，當細胞融合度達到60%時，將四組細胞與培養基混合，充分混勻后，37℃，5% CO2培養箱中培養。

1.3 統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1 靶基因預測 轉染 miR-125b mimics組Smad4 mRNA的相對表達量(0.36±0.09)顯著低于miR-125b NC組(0.98±0.11)，轉染miR-125b inhibitor組(3.45±0.23)顯著高于miR-125b NC組(P<0.01)，Western印跡的檢測結果與其一致。其中miR-125bNC組Smad4蛋白表達量為0.657±0.100，miR-125bmimics組為0.221±0.050,miR-125b inhibitor組為1.181±0.090。為了更準確地證實Smad4是miR-125b的靶基因，接下來進行雙熒光素酶檢測，通過三組共轉染，即Wt-Smad4與miR-125b mimics、Mut-Smad4和miR-125b mimics以及 miR-NC與miR-125b mimics。結果發現，Wt-Smad4與miR-125b mimics組熒光素酶活性(0.45±0.06)顯著低于miR-NC(1.00±0.11)與miR-125b mimics組(0.95±0.09，P<0.01)，Mut-Smad4和miR-125b mimics與miR-NC和miR-125b mimics之間差異不顯著(P>0.05)。這些結果證實Smad4是miR-125b的靶基因。見圖1。

圖1 Western印跡檢測轉染后Smad4的蛋白表達量

2.2 miR-125b對HMSC-bm細胞分化的影響 將miR-125b mimics和si-Smad4轉染到HMSC-bm細胞，誘導劑誘導分化后7 d收集樣品。qRT-PCR檢測Runx2和Osterix mRNA表達量，miR-125b mimics、si-Smad4 Runx2 mRNA表達量(0.38±0.06，0.50±0.07)和Osterix mRNA表達量(0.49±0.05，0.60±0.06)顯著低于對照組(1.00±0.04,1.00±0.05,P<0.01)，說明 miR-125b能靶向調節Smad4調控HMSC-bm細胞分化。

2.3 miR-125b對細胞增殖的影響 轉染后24、48、72 h，miR-125b mimics組在3個時間點細胞的增殖率顯著高于對照組(P<0.01)，miR-125b inhibitor 組顯著低于對照組(P<0.01)，說明miR-125b能對細胞的增殖有調控作用。見圖2。

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01圖2 miR-125b對細胞增殖的影響

2.4 共轉染對細胞增殖的影響 將miR-125b mimics與pcDNA3.1-Smad4質粒共轉染；miR-125b mimics；miR-NC組；miR-NC與pcDNA3.1-Smad4組轉染到細胞后72 h，收集細胞，CCK8檢測細胞增殖，圖3顯示，miR-125b mimics組細胞增殖顯著高于miR-NC組(P<0.01)，miR-125b mimics與pcDNA3.1-Smad4質粒共轉染組細胞增殖顯著高于miR-NC(P<0.05)，miR-NC與pcDNA3.1-Smad4組細胞增殖顯著低于miR-NC組(P<0.05)。說明過表達Smad4減弱了miR-125b對細胞的增殖。

與miR-NC比較：1)P<0.05，2)P<0.01圖3 轉染后不同時間點各組細胞增殖率

2.5 共轉染對細胞分化的影響 將miR-125b mimics與pcDNA3.1-Smad4質粒共轉染；miR-125b mimics；miR-NC組；miR-NC與pcDNA3.1-Smad4組轉染到細胞，誘導劑誘導分化后7 d收集樣品。qRT-PCR檢測細胞中Runx2和Osterix mRNA表達量，結果顯示，miR-125b mimics組(3.92±0.18，3.81±0.23)和miR-125b mimics+pcDNA3.1-Smad4組(2.23±0.14，2.01±0.12)細胞中Runx2和Osterix的mRNA相對表達量顯著高于miR-NC組(0.99±0.02,0.98±0.03,P<0.01)；miR-NC+pcDNA3.1-Smad4組細胞中Runx2和Osterix的mRNA相對表達量(0.40±0.07,0.45±0.08)顯著低于miR-NC組(P<0.01)。

3 討 論

目前沒有一種學說能很好地解釋非創傷性股骨頭壞死的病因和發病機制〔6〕。研究者發現，非創傷性股骨頭壞死的MSCs數量降低，增殖能力降低，成骨能力減弱，然而成脂能力增強；非創傷性股骨頭壞死與MSCs有關〔7〕。miRNA是一種進化保守、數量多的小分子RNA，在轉錄后調控中起到重要的作用〔8〕。研究發現，miRNA在干細胞的分化、增殖等過程中發揮作用，對調控MSCs成骨成脂分化過程也有重要作用，miR-125b能抑制MSCs的成骨分化〔9〕。然而，miR-125b是何種機制調控MSCs的增殖分化還需要進一步探索。

Runx2是成骨細胞成骨和分化過程中重要的控制基因，可促進成骨細胞標志物的表達，當Runx2基因缺失，會引起骨發育不良或者發育終止〔10〕。Osterix是在Runx2之后發現的成骨細胞分化關鍵的轉錄因子，研究發現，缺乏Osterix的小鼠，軟骨內成骨和膜內成骨缺乏，成骨細胞分化的各種標志物的表達也將下降〔11〕。這說明這兩個基因對骨髓干細胞的分化起了重要的作用。本研究說明 miR-125b能靶向調節Smad4調控HMSC-bm細胞分化。另外，本研究說明轉染 miR-125b能對細胞的增殖有調控作用。這也提示在創傷性股骨頭壞死患者治療時，可以通過轉染高低表達的miRNA的表達來實現。miR-125b對骨髓干細胞增殖有影響，而且本研究說明過表達Smad4抑制減弱了miR-125b對細胞的增殖。

綜上，Smad4是miR-125b的靶基因，上調miR-125b促進細胞增殖，下調miR-125b減弱細胞增殖，miR-125b靶向Smad4影響HMSC-bm的增殖和分化。

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〔2016-10-11修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

童 哲(1981-)，男，主治醫師，主要從事創傷、顯微研究。

李 鈞(1969-)，男，副主任醫師，碩士，主要從事創傷、顯微研究。

R681.8

A

1005-9202(2017)02-0306-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.020