顯齒蛇葡萄提取物的體內和體外降血糖效果

張 斌

(漯河醫學高等專科學校，河南 漯河 462002)

顯齒蛇葡萄提取物的體內和體外降血糖效果

張 斌

(漯河醫學高等專科學校，河南 漯河 462002)

目的 探討不同顯齒蛇葡萄提取物體外降血糖及抗氧化和體內降血糖效果研究。方法 利用正己烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇和70%的乙醇提取顯齒蛇葡萄中的活性成分，得到不同提取物，測定其中總酚和總黃酮的含量，考察對α-葡萄糖苷酶的抑制效果和對DPPH及ABTS的清除效果，體內降血糖效果是利用鏈脲佐菌素誘導小鼠糖尿病模型，正己烷提取物(HE)、氯仿提取物(CE)、乙酸乙酯提取物(EAE)、甲醇提取物(ME)和70%的乙醇提取物(EE)按劑量200 mg/kg體重治療4 w，每周末尾部動脈取血測定血糖，4 w后眼眶取血測定血清胰島素。結果 不同提取物中，EE中總酚類物質和總黃酮來物質的含量最高，其次是ME，HE中該兩種成分含量最低，體外降血糖效果發現EE對α-葡萄糖苷酶具有較強的抑制活性并且體現劑量依賴性，體外抗氧化實驗發現EE對DPPH和ABTS具有較強的清楚效果，而體內降血糖效果發現不同提取物對糖尿病小鼠具有一定的降血糖效果，特別是EE組降血糖效果非常明顯，血清胰島素的含量得到明顯提高。結論 顯齒蛇葡萄70%EE具有明顯的抗氧化和降血糖效果，是一種具有很大潛力的降血糖和抗氧化的天然藥物。

顯齒蛇葡萄；降血糖；α-葡萄糖苷酶；抗氧化

糖尿病及其并發癥嚴重威脅人類健康，在各類疾病中死亡率居第3位〔1〕。植物提取物的降血糖作用已得到證實〔2～5〕。顯齒蛇葡萄屬于葡萄科蛇葡萄屬藤本植物，主要分布于華中和西南等省少數民族地區，民間作為茶飲用植物已有上千年的應用歷史〔6〕。研究表明，顯齒蛇葡萄葉中主要次生代謝物以黃酮類化合物為主，含量達到45.52%〔7〕，其中以二氫楊梅素含量最高，是天然的抗氧化劑。現代藥理研究表明，顯齒蛇葡萄具有抗氧化，抑菌消炎，降血脂降血壓和護肝效果〔8～11〕。民間常作為降血糖藥物來治療糖尿病，但是至今還沒有相關報道，本研究觀察顯齒蛇葡萄的不同提取物體外和體內降血糖效果。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑 顯齒蛇葡萄采集于信陽，經漯河醫學高等專科學校李成宏老師鑒定為葡萄科蛇葡萄屬藤本植物，憑證標本保存在漯河醫專植物標本館內。嫩葉在50℃～60℃烘干后用中藥粉碎機粉碎過60目篩，備用。清潔級健康KM小白鼠，雄性體質量(20±2)g，由河南斯萊克竟達實驗動物有限公司提供，實驗動物生產許可證號SCKK(豫)2009-0010，分籠飼養，飼料充足飲水不限，室溫20℃～25℃，適應環境5 d后用于實驗。阿卡波糖，α-葡萄糖苷酶，鏈脲佐菌素(STZ)均購自Sigma公司，鹽酸二甲雙胍購自重慶科瑞制藥有限責任公司，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備 AL104電子天平(Mettler-Toledo儀器公司)；RE-52AA旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；CTXNW-10B超聲波循環提取機(北京弘祥生物技術開發公司)；Free Style 利舒坦雅培血糖儀(美國Abbott Diabetes Care公司)；DU-800紫外掃描分光光度計(美國貝克曼庫爾特公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的提取 準確稱取顯齒蛇葡萄葉粉末2 000 g 5份，分別用20倍體積的正己烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇和70%的乙醇浸泡24 h后，利用循環超聲波提取儀提取45 min，減壓濃縮回收得提取物，再經過冷凍干燥得到5個提取物，分別是正己烷提取物(HE)、氯仿提取物(CE)、乙酸乙酯提取物(EAE)、甲醇提取物(ME)以及70%乙醇提取物(EE)。

1.3.2 總酚和總黃酮的含量以及對DPPH和ABTS清除率的測定 顯齒蛇葡萄不同提取物中的總酚和總黃酮的含量測定參照文獻〔12〕進行測定。另外，DPPH和ABTS自由基清除作用依照文獻〔12〕方法進行測定，對DPPH清除時不同提取物的濃度為5～500 μg/ml，對ABTS清除時不同提取物的濃度為1～50 μg/ml，用BHT作為對照。

1.3.3 體外降血糖效果評價 參照參考文獻〔9〕的測定方法，略作修改。分別取60 μl不同提取待測液(0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/ml樣品液、阿卡波糖溶液以及蘆丁溶液，同量的緩沖液作為空白對照)于96孔酶標板中，加入50 μl α-葡萄糖苷酶溶液(0.2 U/ml)，振勻后于37℃水浴保溫10 min，加入50 μl 5.0 mmol/L PNPG溶液振勻，在37℃水浴中反應20 min，加入160 μl Na2CO3溶液(0.2 mol/L)終止酶促反應，置于405 nm 波長處測吸光度(A)。由于顯齒蛇葡萄提取物本身有顏色，因此每個樣品需要測定背景吸收，并最終測定結果進行校正。每個樣品重復3 次取平均值。抑制率(%)=(A0-AS)/A0 ×100%。式中：AS為樣品組吸光度；A0為空白對照組吸光度。

1.3.4 顯齒蛇葡萄提取物體內降血糖效果檢測 100只KM小鼠禁食12 h后，注射STZ 150 mg/kg(用pH4.5的檸檬酸鈉溶液配制成),72 h后，尾部動脈取血測定血糖含量，血糖含量>11.1 mmol/L為造模成功的小鼠〔12〕。

選取小鼠80只，隨機分為8組，正常組(蒸餾水)，控制組，二甲雙胍組(30 mg/kg體重)，以及顯齒蛇葡萄不同提取物(200 mg/kg體重)劑量組，小鼠分籠飼養，每天按劑量給藥1次，自由進食、飲水。實驗周期4 w，在實驗1、2、3、4 w末尾靜脈采血，測空腹血糖。實驗第4周末，乙醚麻醉小鼠后摘取眼眶取血，血樣4℃3 500 r/min離心10 min后取血清用來測定血清胰島素水平。

1.4 統計學方法 應用SPSS16.0軟件行方差分析和t檢驗。

2 結 果

2.1 顯齒蛇葡萄不同提取物中總酚和總黃酮含量以及對DPPH和ABTS清除率的測定 70%EE中的總酚和總黃酮含量均為最高，而其他提取物中的總酚和總黃酮含量是不同的，利用體外抗氧化實驗如對DPPH和ABTS的清除效果評價提取物的活性，從IC50的只可以看出，70%EE對DPPH和ABTS具有明顯的清除效果。其他提取物對DPPH和ABTS的清楚效果是根據總酚和總黃酮的含量呈正相關。總酚和總黃酮含量越高，清除效果越好，說明總酚和總黃酮是顯齒蛇葡萄中的主要起作用的物質。見表1。

表1 顯齒蛇葡萄中不同提取物總酚、總黃酮含量以及DPPH和ABTS的IC50值

與BHT比較：1)P<0.05，2)P<0.01

2.2 不同提取物對α-葡萄糖苷酶活性抑制 不同提取物中，EE對α-葡萄糖苷酶的抑制活性最好，其次是ME，抑制效果最差的是HE，說明高含量的總酚類物質和總黃酮類物質的提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制具有較強的活性，另外每種提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性隨著劑量的增大，抑制活性隨著增大，說明顯齒蛇葡萄提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性是劑量依賴型的。比較不同質量濃度顯齒蛇葡萄、阿卡波糖和蘆丁對α-葡萄糖苷酶抑制活性可看出，隨質量濃度增加，EE和ME對α-葡萄糖苷酶抑制活性好于蘆丁，但低于阿卡波糖。見圖1。

2.3 不同提取物體內降血糖效果研究 與正常組比較，STZ致糖尿病小鼠的血糖含量明顯升高，經過4 w的治療后，與控制組比較，經過不同提取物的治療發現，各治療組的糖尿病小鼠的血糖含量顯著降低(P<0.01)，且EE-200 mg/kg劑量組小鼠的血糖含量與二甲雙胍組小鼠的血糖含量在4 w后比較相近，結果說明顯齒蛇葡萄具有較強的降血糖效果，并且體現為70% EE的降血糖效果最佳。見表2。

圖1 不同提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果

組別0w1w2w3w4w正常組65±0576±0875±0668±0865±03控制組225±18248±08256±13176±14285±13二甲雙胍組218±164179±042)168±132)159±141)87±142)HE組215±05206±031)196±182)195±051)175±112)CE組233±21225±15206±151)195±141)175±182)EAE組244±15228±13195±122)178±16149±212)ME組234±08218±11185±122)168±08135±142)EE組225±15205±071)165±112)135±062)89±142)

與控制組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

2.4 不同提取物對糖尿病小鼠血清胰島素含量的影響 糖尿病小鼠血清中的胰島素含量〔(21.4±2.7)mIU/L〕明顯低于正常小鼠〔(51.2±3.5)mIU/L〕血清中的血清，說明經過STZ造模后，胰島細胞遭到破壞，抑制胰島素的分泌，經二甲雙胍和不同提取物的4 w治療，二甲雙胍組〔(36.8±3.1)mIU/L〕小鼠中血清含量明顯提高(P<0.01)，但是HE組〔(23.6±2.5)mIU/L〕和CE組〔(24.1±2.4)mIU/L〕小鼠血清中胰島素的含量提高不大，說明這兩個提取物對糖尿病小鼠治療效果不明顯，而EAE組〔(31.2±2.8)mIU/L〕、ME組〔(32.4±2.6)mIU/L〕和EE組〔(40.5±2.4)mIU/L〕小鼠血清中的胰島素含量得到明顯提高(P<0.01,P<0.05)，尤其是EE組小鼠血清中的胰島素提高幅度較大，僅次于二甲雙胍組中的含量。

3 討 論

本文結果說明顯齒蛇葡萄中主要活性物質是酚類物質和黃酮類物質，酚類物質和黃酮類物質成為當今研究熱點，尤其在降血糖、抗氧化等方面取得了顯著的成果〔13,14〕，本研究發現不同提取物中70%EE中的酚類物質和黃酮類物質含量最高，并且對DPPH和ABTS呈現了極高的清除效果。α-葡萄糖苷酶主要是催化淀粉(多糖)分解成單糖尤其是葡萄糖〔15〕。多種抑制劑如阿卡波糖和伏格列波糖都可以抑制α-葡萄糖苷酶，延緩雙糖(淀粉在淀粉酶作用下水解為雙糖)在α-葡萄糖苷酶作用下分解為單糖，延緩葡萄糖與果糖的吸收速度，從而降低餐后血糖，實驗發現，不同提取物對α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制效果，但是EE的抑制效果最好，接近阿卡波糖的抑制效果，從而降低餐后的高血糖。糖尿病小鼠經過顯齒蛇葡萄提取物4 w治療后，小鼠中血糖含量明顯減低，可能是顯齒蛇葡萄提取物作為抗氧化劑防止胰腺β-細胞進一步受損的同時刺激受損胰腺β-細胞的修復和刺激胰腺β-細胞大量分泌胰島素。另外，胰島素的分泌能夠刺激肝糖原的合成和抑制肝糖原磷酸化酶〔16〕，促進肝糖原的沉積，有利于血糖的降低。

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〔2015-07-05修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

張 斌(1980-)，女，講師，主要從事中醫學教學和研究。

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A

1005-9202(2017)02-0321-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.026