來那度胺對人肝癌SMMC-7721細胞生長的影響

孫 靜 任熙玲 曹珮華 武永紅

(西安醫學院醫學技術系，陜西 西安 710021)

來那度胺對人肝癌SMMC-7721細胞生長的影響

孫 靜 任熙玲 曹珮華 武永紅

(西安醫學院醫學技術系，陜西 西安 710021)

目的 探討來那度胺對人肝癌SMMC-7721細胞增殖的抑制作用及其可能機制。方法 利用MTS法檢測來那度胺對SMMC-7721細胞增殖的影響；實時定量PCR、Western印跡檢測來那度胺作用于SMMC-7721細胞后血管內皮生長因子(VEGF)的表達。結果 50 μmol/L 的來那度胺對肝癌細胞SMMC-7721增殖有抑制作用；實時定量PCR和Western印跡結果顯示，以25、50、100 μmol/L 來那度胺處理SMMC-7721細胞12 h后，VEGF mRNA表達水平顯著減低(P<0.05)；Western印跡結果表明，25、50、100 μmol/L 來那度胺處理SMMC-7721細胞24 h后，VEGF蛋白表達水平明顯下調(P<0.05)。結論 來那度胺可能通過抑制腫瘤細胞增殖、抑制腫瘤血管生成發揮雙重抗腫瘤作用。

來那度胺；肝癌；血管內皮生長因子

肝癌(HCC)是最常見，最具侵襲力的惡性腫瘤之一〔1，2〕。臨床治療HCC的首選方案是手術，但由于其起病隱匿發現時大多屬于中晚期，失去手術時機〔3〕。因此,存在手術禁忌證、不可切除的、失去手術時機晚期HCC的首選治療方法是動脈介入化療栓塞術(TACE)。但HCC對傳統化療藥物易產生耐藥性，且敏感度低，因此臨床迫切需要尋找一種新的化療藥物。來那度胺是沙利度胺的新一代衍生物，具有抑制血管生成和免疫調節作用，是一種新型抗腫瘤藥物。它應用于血液系統腫瘤，療效顯著，但其在HCC的研究與應用少有文獻報道。本實驗探討來那度胺對SMMC-7721細胞生長的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑 人肝癌SMMC-7721細胞株引自中國科學院上海細胞生物研究所；RPMI 1640培養基購自美國Gibco公司；來那度胺、二甲基亞砜購自美國Sigma公司；小牛血清購自杭州四季青生物工程公司；胰蛋白酶購自美國Amresco公司；MTS溶液、總RNA Kit購自美國Promega公司；鼠抗人血管內皮生長因子(VEGF)抗體、GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人肝癌SMMC-7721細胞株以含有10%小牛血清，1%青、鏈霉素的RPMI1640培養基培養。細胞培養瓶置于5%CO2，37℃培養箱，隔1天換液1次，2～3 d進行一次傳代。

1.2.2 細胞增殖實驗 收集對數生長期的SMMC-7721細胞，接種于96孔板，濃度為每孔2 000個細胞，培養細胞24 h。移去上清液，以25、50和100 μmol/L來那度胺處理細胞，每個濃度設6個復孔，對照組為不加藥物組。培養箱繼續培養24 h后加入MTS溶液，每孔20 μl，繼續培養4 h后，搖床低速振蕩10 min，測量各孔在490 nm處吸光值。增殖率=(各組所得到的吸光值/空白對照組平均值)×100%。

1.2.3 實時定量PCR 取對數生長期SMMC-7721細胞，以1×105/ml，1 ml接種于6孔板中，將培養體系最終調整為2 ml，培養細胞24 h。移除上清液，以RPMI 1640稀釋的來那度胺處理細胞，藥物終濃度分別為25、50和100 μmol/L。每個濃度設3個復孔，對照組為不加藥物組。繼續培養24 h后，根據試劑盒說明書以總RNA 提取試劑盒提取細胞總RNA、反轉錄，進行20 μl體系實時定量PCR操作。VEGF基因引物及內參 GAPDH 基因引物由華大基因公司設計合成，VEGF正義鏈5'AGGGCAGAATCATCACGAAGT 3'；反義鏈5'AGGGTCTCGATTGGATGGCA3'；GAPDH正義鏈5'GCACCGTCAAGGCTGAGAAC5'，反義鏈5'TGGTGAAGACGCCAGTGGA3'。反應條件：預變性95℃，30 s；變性95℃，30 s；延伸58℃，34 s；循環45 個；GAPDH為內參，每個樣本設3個復孔，實驗結果以GraphPad.Prism.v5.0軟件進行數據分析，相對表達量采用2-△△Ct方法計算〔3〕。

1.2.4 Western印跡 取對數生長期細胞，接種于6孔板，密度為1×105/ml，培養細胞24 h。移除上清液，以25、50和100 μmol/L來那度胺處理細胞，每個實驗孔設3個復孔，對照組為不加藥物組。裂解細胞提取總蛋白并測定蛋白濃度，取變性蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉 PVDF膜，封閉、洗膜后與VEGF、GAPDH一抗4℃孵育過夜，洗膜后加二抗，37℃孵育1 h，蛋白質印跡檢測采用化學發光劑。

1.3 統計學方法 采用SPSS15.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1 來那度胺對人肝癌SMMC-7721細胞增殖能力的作用 對照組細胞增殖率為(93.5±4.9)%，25、50、100 μmol/L組細胞增殖率為(78.5±6.4)%、(56.0±5.7)%、(32.5±3.5)%來那度胺可以抑制肝癌細胞的增殖(P<0.05)。

2.2 來那度胺對肝癌SMMC-7721細胞株VEGF mRNA表達水平的影響 以25、50和100 μmol/L來那度胺處理肝癌SMMC-7721細胞12 h后，VEGF mRNA表達水平分別為(14.0±2.8)、(5.5±0.7)、(3.5±0.7)，較對照組(18.0±1.4)明顯下調(P<0.05)，表明來那度胺可呈劑量依賴性明顯下調VEGF。

2.3 來那度胺對肝癌SMMC-7721細胞株VEGF蛋白表達水平的影響 以25、50和100 μmol/L來那度胺處理肝癌SMMC-7721細胞24 h后，Western印跡結果顯示，VEGF 蛋白表達水平下調(P<0.05)，說明來那度胺可呈劑量依賴性下調VEGF，結果見圖1。

1:對照組;2:來那度胺25 μmol/L;3：來那度胺50 μmol/L；4：來那度胺100 μmol/L圖1 來那度胺對SMMC-7721 VEGF蛋白表達的作用

3 討 論

近年來，來那度胺作為沙利度胺新一代的衍生物頗受關注，它在多種血液系統腫瘤的治療中得到了廣泛的研究和應用〔4～6〕,同時對于實體腫瘤的治療研究也有報道〔7〕。本研究結果表明，在體外實驗中，來那度胺可以抑制肝癌細胞的增殖，而且這種抑制增殖的作用隨著藥物濃度的增加而逐漸增強。HCC的復發轉移是影響其預后的最主要原因，而腫瘤的生長、侵襲、轉移都伴隨血管新生?？寡苄律强鼓[瘤侵襲轉移的重要策略之一。VEGF是一種重要的腫瘤新生血管分子標志〔8〕，可以促進血管內皮細胞分裂增殖、加強血管新生，增加血管通透性。本研究表明，在不同濃度的來那度胺作用下，肝癌SMMC-7721細胞內VEGF mRNA和蛋白的表達水平隨藥物濃度增加明顯下調。綜上所述，沙利度胺可能通過抑制腫瘤細胞生長、抗血管生成而發揮雙重抗腫瘤的作用。進一步研究來那度胺抗腫瘤的詳細分子機制，對來那度胺治療肝癌的臨床應用具有重要意義。

1 Jemal A，Bray F，Center MM，etal.Global cancer statistics〔J〕.CA Cancer J Clin，2011;61(2)：69-90.

2 Bruix J，Gores GJ，Mazzaferro V.Hepatocellular carcinoma：clinical frontiers and perspectives〔J〕.Gut，2014;63(5)：844-55.

3 Livak KJ,Schmittqen TD.Analysis of relative gene expression data using real-Time quantitative PCR and the 2-△△Ct method〔J〕.Methods，2001；25(3)：402-8.

4 Rosovsky R，Hong F，Tocco D，etal.Endothelial stress products and coagulation markers in patients with multiple myeloma treated with lenalidomide plus dexamethasone:an observational study〔J〕.Br J Haematol，2013；160(2):351-8.

5 Coman T，Bachy E，Michallet M，etal.Lenalidomide as salvage treatment for multiple myeloma relapsing after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation:a report from the French Society of Bone Marrow and Cellular Therapy〔J〕.Haematologica，2013；98(5):776-83.

6 Riches JC，Ramsay AG，Gribben JG.Immune reconstitution in chronic lymphocytic leukemia〔J〕.Curr Hematol Malig Rep，2012;7(1)：13.

7 Brosseau C,Colston K,Dalgleish AG,etal.The immunomodulatory drug lenalidomide restores a vitamin D sensitive phenotype to the vitamin D resistant breast cancer cell line MDA-MB-231 through inhibition of BCL-2:potential for breast cancer therapeutics〔J〕.Apoptosis,2010;17(2):164-73.

8 趙建龍,王胐胐,李世朋,等.VEGF、LYVE-1 在肝癌組織中的表達與意義〔J〕.中國老年學雜志，2014;34(8):2167-9.

〔2015-04-22修回〕

(編輯 安冉冉/曹夢園)

孫 靜(1977-)，女，副教授，在讀博士，主要從事腫瘤分子影像學研究。

R735

A

1005-9202(2017)02-0323-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.027