原發性血小板增多癥患者治療中出現慢性粒細胞白血病1例

劉景華 周 凡 劉 洋 張曉琳 李敏燕 劉彥琴 王吉剛 白 穎

(沈陽軍區總醫院，遼寧 沈陽 110016)

原發性血小板增多癥患者治療中出現慢性粒細胞白血病1例

劉景華 周 凡 劉 洋 張曉琳 李敏燕 劉彥琴 王吉剛 白 穎

(沈陽軍區總醫院，遼寧 沈陽 110016)

目的 認識Ph1陰性原發性血小板增多癥在病程中向BCR-ABL1陽性慢性粒細胞白血病的轉變。方法 密切監測患者骨髓巨核細胞的形態、BCR/ABL P210融合基因轉錄水平、FISH法Ph1染色體、JAK2基因V617F突變。結果 初診時患者骨髓巨核細胞胞體大、多分葉核，BCR/ABL P210融合基因陰性，Ph1染色體陰性，JAK2基因為野生型；33個月后患者骨髓巨核細胞形態轉為單圓核小巨核細胞，BCR/ ABL P210融合基因轉為陽性，Ph1染色體轉為陽性，JAK2基因仍為野生型。結論 該患者由Ph1陰性原發性血小板增多癥在治療過程中轉為BCR-ABL1陽性慢性粒細胞白血病。

原發性血小板增多癥；慢性粒細胞白血病

骨髓增殖性腫瘤(MPN)是克隆性造血干細胞疾病，分為BCR-ABL陽性慢性髓細胞白血病(CML)和BCR-ABL陰性MPN，后者包括原發性血小板增多癥(ET)，真性紅細胞增多癥(PV)和原發性骨髓纖維化(PMF)。雖然CML和ET在初期的臨床表現和臨床過程上是明顯不同的，但一些CML和ET病例有重疊的臨床特點，可能會出現ET和CML的共存〔1〕，也可能會出現ET和CML的交替〔2〕。現將1例ET轉化為CML的病例報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 患者，女，72歲，因反復心前區疼痛于2011年1月4日首次就診我科，于2010年10月末情緒激動后出現心前區陣發性疼痛，持續2～3 s，服用速效救心丸后，癥狀瞬間緩解。于11月25日精神受打擊后突發耳鳴，聽力下降，同時伴有咽痛，就診于某醫院耳鼻喉科，行血液分析檢查白細胞13.8×109/L，血紅蛋白131 g/L，血小板541×109/L，肺炎支原體抗體：1∶640，給予左氧氟沙星，長春西汀等對癥治療，聽力逐漸恢復。此期間多次復查血液分析白細胞及血小板均高，白細胞最高達25×109/L，最低降至13.8×109/L。11月29日心前區疼痛加重，再次就診某醫院干診科，24 h動態心電圖提示：房性期前收縮、短陣房速；心臟彩超提示：左室舒張功能減低。給予擴冠、抗炎等治療后癥狀緩解。既往高血壓、腔隙性腦梗死病史。查體：胸骨無叩痛，肝脾肋下未觸及。入院后多次檢查白細胞18×109/L～25×109/L，血紅蛋白130～138 g/L，血小板620×109/L～900×109/L。結合骨髓穿刺、活檢、白細胞堿性磷酸酶、BCR/ABL融合基因、JAK2基因V617F突變及Ph1染色體等檢查，診斷：ET。之后口服羥基脲聯合肌肉注射干擾素α治療，白細胞5×109/L～10×109/L，血紅蛋白110～120 g/L，血小板360×109/L～540×109/L。期間于2012年6月出現全身多關節疼痛，化驗檢查類風濕因子水平增高。于2012年9月行右側人工膝關節表面置換術，2013年10月因全身多關節腫痛伴活動受限，診斷為“類風濕關節炎”，當時化驗檢查白細胞11.1×109/L 血紅蛋白108 g/L，血小板725×109/L，中幼粒細胞1%，晚幼粒細胞2%，嗜酸細胞2%，嗜堿細胞9%。再次就診我院，經復查骨髓穿刺、BCR/ABL融合基因、JAK2基因V617F突變及Ph1染色體等檢查，調整診斷：慢性粒細胞白血病(慢性期)。自2013年10月30日開始口服伊馬替尼400 mg/d，半個月后血小板降至275×109/L，白細胞6.3×109/L。但因關節腫痛加重，患者知情同意下換用尼洛替尼800 mg/d，現服藥4個月，無明顯不適癥狀，血象控制較好。

1.2 骨髓BCR/ABL P210融合基因轉錄水平檢測 留取3～5 ml EDTA抗凝骨髓進行骨髓單個核細胞分離和RNA提取，之后進行逆轉錄合成cDNA及RQ-PCR：在15 μl PCR反應模板中加入含有逆轉錄酶的10 μl PCR反應液，42℃ 37 min，94℃ 5 min；94℃ 15 s，60℃ 60 s，40次循環；37℃ 1 min。ABL基因作為內參照基因。目的基因BCR-ABL(P210)引物及探針序列：上游引物b2：5′-CCGC TGACCATCAATAAGGAA-3′，下游引物a2：5′-CTCAGACCCTGAGGCTCAAA GT-3′；探針BCR-ABL：5′-FAM-AGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCT-TAMRA-3′。內參基因ABL引物及探針序列：上游引物ENF1003：5′-TGGAGA TAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3′，下游引物ENR1063：5′-TGGAGATA ACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3′；探針ENPr1043：5′-FAM-CCATTTTTG GTTTGGGCTTCACACCATT-TAMRA-3′。

1.3 JAK2基因V617F突變的檢測 留取3～5 ml EDTA抗凝骨髓液，提取DNA。采用AS-PCR方法。PCR反應體系為：10×PCR緩沖液2.5 μl，10 μmol/L的F1引物1.2 μl(正義引物：5′-GT-GAATAGTCCTAGTGTTTTCAGTTTCA-3′)、F2引物1.3 μl(正義引物：5′-AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3′)、R引物2.5 μl(反義引物：5′-ATCTATAGTCATGCTGAAAGTAGGAGAAAG-3′)，50 ng/μl模板DNA 2 μl，2 μl的25 mmol/L MgCl2，2 μl的各種dNTP和2 μl Taq DNA聚合酶，加雙蒸水至12.5 μl。之后進行瓊脂糖凝膠電泳及測序。

1.4 Ph1染色體FISH的檢測 留取3～5 ml肝素抗凝骨髓液。采用Spectrum Orange標記的序列特異性DNA探針ABL及Spectrum Green標記的序列特異性DNA探針BCR。探針處理：每份標本探針1 μl，加雜交稀釋液4 μl混勻，將探針混合液5 μl加于玻片的待雜交區，蓋上玻片。用橡膠膠水封片后，放于自動原位雜交儀中，程序設定78℃ 變性5 min，42℃雜交20 h。雜交結束后，洗片，去除蓋玻片，將玻片置于46℃的0.3% NP-40/0.4×SSC中洗滌2 min，再置于2×SSC/0.1NP-40中洗滌45 s，置于2×SSC中脫水4 min，再置于70%的酒精中脫水4 min，取出玻片，晾干，復染，吸取10 μl的DAPI于雜交區，置于4℃冰箱，待30 min后觀察結果。

2 結 果

2.1 初診骨髓涂片及活檢 骨髓涂片：骨髓增生明顯活躍，粒系細胞比例明顯增高，早幼粒細胞1%，中幼粒細胞15%，晚幼粒細胞17.5%，嗜酸粒細胞4.5%，嗜堿粒細胞3%，紅系細胞比例減低，全片共見巨核細胞230只，為胞體大、多分葉核巨核細胞(見圖1)；外周血涂片：未見早、中、晚幼粒細胞，嗜堿粒細胞12%；骨髓活檢：骨髓增生活躍，粒系細胞比例增高，可見各階段細胞散在分布，紅系細胞比例減低，巨核細胞6只，少量纖維細胞增生。

2.2 調整診斷時骨髓涂片 骨髓增生明顯活躍，粒細胞增生明顯活躍，中、晚幼粒細胞比值增高，原始粒細胞0.8%，早幼粒細胞2.4%，中幼粒細胞23.2%，晚幼粒細胞24%，紅細胞增生減低，全片見巨核細胞220只，為單圓核小巨核細胞(見圖1)。

圖1 初診及調整診斷時骨髓巨核細胞形態(×100)

2.3 初診基因及染色體等相關檢查 骨髓細胞BCR/ABL P210融合基因定量檢測：陰性；外周血細胞BCR/ABL熒光原位雜交FISH檢測：陰性(見圖2)；骨髓細胞JAK2基因為野生型；骨髓白細胞堿性磷酸酶陽性率14% 積分14分。

2.4 調整診斷時基因及染色體等相關檢查 骨髓細胞BCR/ABL P210融合基因定量檢測：陽性；外周血細胞BCR/ABL熒光原位雜交FISH檢測(見圖2)：陽性；骨髓細胞JAK2基因為野生型。

圖2 初診及調整診斷時外周血細胞BCR/ABL熒光原位雜交FISH檢測(×100)

3 討 論

MPN傳統上分為BCR-ABL陽性的CML和BCR-ABL陰性的MPN，后者包括原發性PMF、PV和ET。雖然在2005年前pubmed上曾報道數篇的Ph陽性ET〔3,4〕，但此后隨著對疾病性質的進一步認識及疾病定義的進一步限定，目前對于PMF和ET的診斷要求是沒有Ph染色體，而Ph染色體的存在是診斷CML的必備條件。然而，當Ph染色體陽性MPN缺乏CML的典型特征〔5〕(白細胞增高并核左移、脾臟腫大、嗜堿性粒細胞增多、小單圓核巨核細胞)時，會給臨床醫生在疾病的診斷過程中帶來不少困惑。

我們的病例在初始診斷時符合WHO對于ET的診斷標準〔6〕：①血小板>450×109/L；②巨核細胞增殖，體積大，形態成熟，無粒系或紅系增殖；③除外CML、PV、PMF、骨髓增生異常綜合征(MDS)或其他髓系腫瘤；④證實存在JAK2V617F或其他克隆標記；或沒有反應性血小板增多的證據。自診斷以來給予羥基脲聯合干擾素α治療，起初血小板控制較好，但在2年后血小板控制不佳，此時白細胞數值與初診時相當，但骨髓巨核細胞由初診時的胞體大、多分葉核巨核細胞轉為單圓核小巨核細胞，同時骨髓細胞BCR/ABL P210融合基因定量檢測陽性，外周血細胞BCR/ABL熒光原位雜交FISH檢測陽性，此時患者不再符合ET，而轉化為CML。

CML和ET均是克隆性造血干細胞疾病，雖然通常在初期的臨床表現和臨床過程上是明顯不同的，但一些CML和ET病例有重疊的臨床特點，可能會出現ET和CML的共存〔1〕，也可能會出現ET和CML的交替〔2〕。Wahlin等〔2〕首次報道1例58歲的男性ET患者在羥基脲治療18年后轉化為CML，之后該患者進行了異基因造血干細胞移植。隨后Curtin等〔7〕報道1例患者在診斷Ph陰性ET前存在長時間的孤立血小板增高的病史，在ET診斷后4個月檢測到Ph染色體。Cesar等〔8〕報道1例65歲的女性ET患者，在羥基脲治療6年后，血小板數量不能控制，此時檢測到Ph染色體，之后應用伊馬替尼治療，血小板數量得到控制。此后Mizutani等〔9〕報道1例72歲的男性ET患者在羥基脲治療9年后血小板逐漸降低，白細胞上升，此時通過染色體及基因學的檢查，證實交替為CML，之后改為伊馬替尼治療，4個月后因出現胸腔積液而調整為尼洛替尼治療，在治療5個月后CCyR，但此時血小板再次上升，之后需尼洛替尼和羥基脲共同應用控制病情。Santos等〔10〕報道1例41歲男性ET患者2年后轉化為CML，在伊馬替尼治療后BCR-ABL1水平下降的同時血小板再次上升，之后需伊馬替尼和羥基脲共同應用控制血小板數量。

Mizutani等〔9〕和Santos等〔10〕所報道的病例均出現一致的現象：起初臨床表現為Ph-ET，隨后交替為Ph+CML，在應用對BCR-ABL靶向治療的酪氨酸激酶抑制劑后，在BCR-ABL1水平下降的同時血小板再次上升。上述現象我們推測可能有如下機制：Ph-和Ph+克隆可能在發病時即共同存在于患者體內，只是在不同的時期不同的克隆占優勢而導致臨床表現及檢測結果的不同，及應用目前檢測手段表現為Ph-ET和Ph+CML的交替。Ph-和Ph+克隆間相互抑制，ET交替為CML患者，在發病時Ph-克隆占優勢，表現為ET，隨著長時間的治療，其被抑制，之后表現為Ph+克隆占優勢，而表現為CML，隨著酪氨酸激酶抑制劑的應用抑制了Ph+克隆的增殖，從而為Ph-克隆的增殖提供了空間，使得再次表現為ET。另外伊馬替尼對于c-kit的抑制作用強于尼洛替尼，導致尼洛替尼組Ph-克隆的相對弱抑制，推測可能應用尼洛替尼發生ET復發的概率更大。

盡管Ph-MPN在治療過程中出現Ph+CML是非常少見的，兩者的臨床表現有時又相似，但它們需要不同的靶向治療，因此臨床醫生需要細致地將兩者進行鑒別診斷，以便更好地治療。

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2 Wahlin A，Golovleva I.Emergence of Philadelphia positive chronic myeloid leukaemia during treatment with hydroxyurea for Philadelphia negative essential thrombocythaemia〔J〕.Eur J Haematol，2003；70(4)：240-1.

3 Michiels JJ，Berneman Z，Schroyens W，etal.Philadelphia(Ph)chromosome-positive thrombocythemia without features of chronic myeloid leukemia in peripheral blood：natural history and diagnostic differentiation from Ph-negative essential thrombocythemia〔J〕.Ann Hematol，2004；83(8)：504-12.

4 Daly K，Nandula SV，Murty VV，etal.Variant translocation with a deletion of derivative(9q)in a case of Philadelphia chromosome positive(Ph+)essential thrombocythemia(ET)，a variant of Chronic Myelogenous Leukemia(CML)with a poor prognosis〔J〕.Leukemia Lymphoma,2005;46(12)：1801-6.

5 Voican I，Vladareanu AM，Bumbea H，etal.CML patients in the molecular era-report of five years experience of diagnosis and treatment in a single center〔J〕.J Med Life,2013;6(3)：319-26.

6 Vardiman JW，Thiele J，Arber DA，etal.The 2008 revision of the world health organization(WHO)classification of myeloid neoplasms and acute leukemia：rationale and important changes〔J〕.Blood,2009;114(5)：937-51.

7 Curtin NJ，Campbell PJ，Green AR，etal.The Philadelphia translocation and pre-existing myeloproliferative disorders〔J〕.Br J Haematol,2005;128(5)：734-6.

8 Cesar JM，Cabello P，Ferro T，etal.Emergence of chronic myelogenous leukemia in a patient with primary thrombocythemia and absence of BCR/ABL rearrangement〔J〕.Cancer Genet Cytogenet,2006;167(1)：74-7.

9 Mizutani S，Kuroda J，Shimizu D，etal.Emergence of chronic myelogenous leukemia during treatment for essential thrombocythemia〔J〕.Int J Hematol,2010;91(3)：516-21.

10 Santos FP，Verstovsek S.JAK2 inhibitors：what′s the true therapeutic potential〔J〕? Blood Rev,2011;25(2)：53-63.

〔2015-06-01修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

遼寧省科技計劃課題(No.2011225021;2013225089)

周 凡(1961-)，男，碩士，主任醫師，主要從事骨髓增殖性腫瘤的診治研究。

劉景華(1976-)，女，博士，副主任醫師，主要從事復發難治性多發性骨髓瘤機制研究。

R733

A

1005-9202(2017)02-0387-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.058