正常人皮膚活檢汗腺神經纖維的分布規律及特點

李 穎 魏云霄 陳龍劍 凌 麗 趙紅杰 譚海波 路 輝

(河北大學附屬醫院，河北 保定 071000)

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正常人皮膚活檢汗腺神經纖維的分布規律及特點

李 穎1魏云霄1陳龍劍1凌 麗 趙紅杰2譚海波2路 輝3

(河北大學附屬醫院，河北 保定 071000)

目的 探討正常人汗腺神經纖維分布的數量和形態學特點，尋找汗腺神經纖維密度的分布規律。方法 收集不同解剖部位、年齡和性別的健康成年人皮膚標本192例，將其分為6個解剖部位、4個年齡組，均男女各半，通過皮膚活檢結合組化技術觀察汗腺神經纖維的數量和形態學。結果 年齡對汗腺神經纖維密度有較大影響；在排除年齡因素影響的情況下，不同性別對汗腺神經纖維密度也有明顯影響。隨肢體取材部位的由近及遠汗腺神經纖維密度表現為逐漸遞減的趨勢，體現了神經軸突“長度依賴性”的特點，這種特點在上肢體現地更為明顯。結論 汗腺神經纖維分布規律特點能為臨床判斷周圍神經損傷起到更好地促進和參考作用。

皮膚活檢；汗腺神經纖維；膽堿酯酶染色

皮膚中具有豐富的神經纖維，它們是周圍神經的末梢部分，很多周圍神經損傷的早期都會在皮膚神經纖維中出現形態和數量的異常，其中自主神經損傷在很大程度上反映了周圍神經損傷的情況，其主要表現為皮膚色澤、溫度、出汗異常等，出汗功能作為評價自主神經功能的指標，能夠反映自主神經損傷及再生的程度，但目前常用地出汗檢查方法如交感皮膚反應、淀粉碘試驗等由于尚欠細致和客觀，因此不能進行精確的定量和評價〔1〕。研究證實，支配汗腺的自主神經纖維為膽堿能神經纖維〔2，3〕，當前膽堿酯酶染色常用來觀察心肌、胰腺、肌肉等組織的自主神經變化，尚無應用此方法對支配汗腺的自主神經纖維進行評估的研究報道。本實驗首次應用膽堿酯酶染色進行汗腺支配神經纖維的定量和形態學觀察，以對汗腺神經纖維密度進行初步的探索，為臨床評價自主神經損傷提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 共收集正常人皮膚標本192例，標本來源于2009年5月至2013年7月河北大學附屬醫院骨科手術的患者以及神經內科接受皮膚活檢的受試者，經倫理委員會批準、受試者知情同意，收集其臨床資料。所有受試者均接受神經系統檢查(包括膝、跟腱反射，拇指遠端針刺感、震動覺和精細觸覺)，除外神經疾病史、糖尿病史、過量飲酒史(指每周飲酒量男性超過21個單位、女性超過14個單位，一個標準單位約含8 g乙醇，相當于250 ml正常強度的啤酒，一小杯的葡萄酒或一個標準分量的烈酒)和神經毒性藥物服用史及其他可能的神經病變危險因素接觸史。

1.2 分組 分別按照年齡、性別及解剖部位進行分組，收集標本時性別分組已經考慮在其他兩種分組之中：①按年齡分組：以20歲為一個年齡段進行分組，分別為≤20歲，21～40歲，41～60歲，≥61歲，每組48例，男女各半。(2)按解剖部位分組：手背，前臂(前臂遠端)，上臂(上臂遠端)，足背，小腿(小腿遠端)，大腿(大腿近端)，每組32例，男女各半。

1.3 主要試劑 碘化乙酰硫代膽堿、多聚賴氨酸(Sigma公司)，醋酸鈉、醋酸、硫酸銅、檸檬酸鈉、鐵氰化鉀、丙酮、蔗糖、磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)，多聚甲醛(國藥集團化學試劑有限公司)，飽和苦味酸、梯度酒精、二甲苯、中性樹脂(我院中心實驗室)。

1.4 實驗方法

1.4.1 標本獲取 (1)骨科手術的患者：于術中將含有全層皮膚及皮下組織的皮膚標本取下后修整為直徑約3 mm的組織塊，并立即投入Zamboni固定液中常規固定。(2)皮膚活檢的受試者：患者仰臥位，充分暴露活檢部位，常規消毒皮膚，戴無菌手套，鋪無菌洞巾，2%利多卡因局部麻醉，在擬取材處行長約1 cm的縱行切口，鈍性分離皮下組織，留取0.3 cm×1 cm大小的全層皮膚組織，并立即投入Zamboni固定液中常規固定。切口徹底止血，清點器械，敷料，關閉切口，再次酒精消毒，無菌紗布覆蓋，膠布加壓固定。術后給予抗感染，止痛等對癥治療。

1.4.2 標本處理 Zamboni固定液中常規固定16～24 h，之后將標本放入20%蔗糖溶液中過夜，直到標本沉至容器底部為止，將標本放入-70℃低溫冰箱中(裝入封口塑料袋內密封)保存備用。染色前，將凍結標本放入恒冷冰凍切片機內進行垂直于皮膚表面的連續切片，用OCT包埋劑將標本固定在金屬栓上，-20℃下恒冷切片機內放置片刻后，即可牢固的固定載有皮膚標本的金屬栓于金屬卡盤上。將切片機設定在切片厚度為15 μm的狀態下，連續切片。

1.4.3 HE染色 (1)將切片放入蘇木精染液7～10 min；(2)自來水沖洗3～5 min；(3)1%鹽酸酒精分化5～10 s；(4)自來水沖洗1～5 min；(5)弱氨水返藍0.5～1 min；(6)自來水沖洗5～10 min；(7)鏡檢著色程度；(8)0.5%水溶性伊紅染液5～10 min；(9)蒸餾水洗數秒鐘；(10)逐級酒精脫水：70%、80%、95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ；(11)二甲苯透明兩次；(12)中性樹膠封固。

1.4.4 膽堿酯酶組織化學染色 采用改良Karnovsky-Root染色法〔4〕進行膽堿酯酶染色。陰性對照：孵育液中不加碘化乙酰硫代膽堿。陽性結果：膽堿酯酶活性部位呈棕紅色或棕黃色。

1.5 觀察指標 (1)汗腺及其支配神經形態學觀察：鏡下觀察各切片汗腺及神經纖維著色情況，在光學顯微鏡下對染色切片進行形態學分析。(2)汗腺支配神經纖維密度定量〔5,6〕分析：400×光學顯微鏡下觀察膽堿能神經著色情況，每個活檢標本至少有3張切片參加定量，每張切片隨機選取3～5個具有汗腺分布的視野進行觀察，使用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件根據陽性神經纖維與背景的灰度差異，對圍繞汗腺的膽堿能神經纖維進行鑒別和定量，結果以陽性神經纖維的面積占汗腺管(包括神經纖維)所占總面積的比率表示，并以百分比表達。

1.6 統計學分析 采用SPSS11.0軟件行單因素方差分析(ANOVA)、q檢驗、u檢驗。

2 結 果

2.1 正常人汗腺組織HE染色形態學特點 在光學顯微鏡下，可清晰地看到淡紅色的外泌汗腺分泌部結構，由單層椎體細胞構成，為單曲管狀，管狀腺體盤旋呈不規則球形，多位于真皮和皮下組織交界處，見圖1。

2.2 正常人汗腺及其支配神經纖維膽堿酯酶染色形態學特點 膽堿酯酶染色后的切片經過蘇木素復染，汗腺組織呈現藍紫色，為盤旋狀不規則球形，支配汗腺的膽堿能神經纖維呈棕色，以環形密集地纏繞分布在汗腺小管周圍，排列及分布均勻不等，有的可呈團簇狀分布，有的分布稀疏，甚至汗腺小管周圍無明顯著色，排列不規則，密度不均勻，見圖2。

圖1 汗腺組織 HE染色(×400)

男67歲，小腿

女 17歲，上臂

2.3 汗腺神經纖維密度定量結果 不同解剖部位之間的比較：汗腺神經纖維密度在不同解剖部位之間存在差異(P<0.05)，上臂與前臂之間、前臂與手背之間、大腿與小腿之間差異顯著、前臂與小腿之間、上臂與大腿之間差異顯著(P<0.01)，小腿與足背之間、前臂與大腿之間、小腿與手背之間、手背與足背之間兩兩比較無差異(P>0.05)，見表1。不同年齡之間的比較：≤20歲組與21～40歲組之間、21～40歲組與41～60歲組之間、21～40歲組與≥61歲組之間兩兩比較差異顯著(均P<0.01)；而≤20歲組與41～60歲組之間、41～60歲組與≥61歲組之間、≤20歲組與≥61歲組之間兩兩比較無差異(均P>0.05)，見表2。不同性別之間的比較：在排除年齡因素影響的情況下，不同性別對汗腺神經纖維密度有明顯影響，男性明顯高于女性(P<0.05)，見表3。

表1 不同解剖部位汗腺神經纖維密度定量結果±s，n=32)

與小腿組比較：1)P<0.05；與前臂組比較：2)P<0.05；與大腿組比較：3)P<0.05

表2 不同年齡組汗腺神經纖維密度定量結果±s，n=48)

與21～40歲組比較：1)P<0.05

表3 不同性別汗腺神經纖維密度定量比較結果±s，n=96)

3 討 論

自主神經是完整神經系統的有機組成部分之一，自主神經功能檢查對評價周圍神經損傷和修復是不可缺少的，其分布到皮膚上的纖維與感覺纖維分布相同，感覺消失區與無汗區相符合。周圍神經損傷后感覺喪失區內的皮膚干燥無汗，隨著神經的再生，出汗逐漸增多。因此檢查出汗功能，對判斷周圍神經損傷及再生的程度具有重要的指導意義〔1,7〕。

目前臨床中檢查汗腺功能的方法，最簡單的方法就是用手指觸摸皮膚，局部有濕潤感表示有汗，也可用放大鏡觀察有無細小的汗點，也可用淀粉碘試驗，即在檢查部位涂1.5%碘酊，干燥后撒上淀粉，然后用紅外線燈烘烤，如出現藍色，表示有出汗功能。但上述方法均較粗糙，無法進行定量評價。

關于泌汗功能的檢查還包括泌汗軸突反射定量試驗、溫控排汗試驗、交感皮膚試驗等，但上述診斷方法，大多由于其本身較為復雜、方法操作繁瑣、設備昂貴不易實施，或受周圍環境、溫度影響，難以客觀定量等，使臨床診斷和應用受到限制〔8〕。

已經有多位學者研究表明〔9～14〕，汗腺神經纖維密度與出汗功能有明顯的相關性，且對周圍神經特別是自主神經纖維損傷起到了一定的參考作用，因此我們采用改良Karnovsky-Root染色法進行膽堿酯酶染色，觀察支配汗腺的膽堿能神經纖維的分布特點和規律。

我們的研究結果發現，在不同解剖部位之間,上臂、前臂、手背和大腿、小腿、足背的汗腺神經纖維密度均存在隨肢體取材部位的由近及遠表現為一個逐漸遞減的趨勢，而前者表現的更為明顯，另外，上臂的汗腺神經纖維密度在所有的解剖部位中是最高的，甚至高于大腿組很多。同時，汗腺神經纖維密度在不同解剖部位的分布差異較緩，且數值變化趨勢趨于平穩。我們沒有發現隨著身體解剖部位的不同，泌汗小管的結構、泌汗神經的支配模式或者免疫反應性有所改變的證據，對于每個小管面積中軸突的密度全身各處是否一致也沒有進行系統的觀察和研究。在不同年齡之間的比較顯示,年齡對汗腺神經纖維密度有較大影響，不同年齡組之間有明顯區別，而且隨著年齡增長，汗腺神經纖維密度有回升的趨勢，密度的最高值集中在≤20歲組和≥61歲組。因此可以看出，年齡對汗腺神經纖維密度的影響有隨著年齡增長的趨勢。與此同時，我們發現不同年齡組汗腺神經纖維密度分布，汗腺神經纖維密度與年齡之間沒有形成直線回歸與直線相關的關系，也就是說隨著年齡的逐漸增長，汗腺神經纖維密度沒有出現明顯的增高或降低的變化趨勢，年齡對其影響比較復雜。

由于自主神經的結構、功能比較復雜，目前對其研究尚欠細致和全面，因此仍無精確的定量評價方法〔1〕。本實驗首次采用皮膚神經活檢結合膽堿酯酶染色的方法對皮膚汗腺的神經支配情況進行病理學觀察，從形態學和分布數量上進行探索研究，該方法具有操作簡單、能夠定量分析和形態學觀察、能夠排除其他人為、環境等干擾因素、方法客觀的特點〔15〕，同時作為一種研究膽堿能神經的方法，它還能夠反映自主神經的病理變化，彌補目前臨床研究的不足。

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〔2015-11-19修回〕

(編輯 李相軍)

河北省自然科學基金項目(H2013201255)；河北省重點研發計劃項目(152777187)

凌 麗(1980-)，女，博士，副主任醫師，碩士生導師，主要從事周圍神經損傷的研究。

李 穎(1982-)，女，主治醫師，主要從事周圍神經損傷研究。

R745.4

A

1005-9202(2017)02-0433-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.079

1 河北大學研究生院 2 河北省望都縣醫院

3 保定市清苑區人民醫院