1株產靈菌紅素家族紅色色素細菌的分離鑒定及其色素性質研究

李春燕，牟希，張媛，陳瑤，楊大成，鄭鵠志，鄭波，周佳海，蔣勇軍，謝建平*

1(西南大學 生命科學學院，現代生物醫藥研究所三峽庫區生態環境與生物資源省部共建國家重點實驗室培育基地，重慶，400715) 2(西南大學 化學化工學院，重慶，400715)3(西南大學 地理科學學院，巖溶環境開放實驗室，重慶，400715) 4(中國科學院 上海有機所，上海，200032)

1株產靈菌紅素家族紅色色素細菌的分離鑒定及其色素性質研究

李春燕1，牟希1，張媛1，陳瑤2，楊大成2，鄭鵠志2，鄭波4，周佳海4，蔣勇軍3，謝建平1*

1(西南大學 生命科學學院，現代生物醫藥研究所三峽庫區生態環境與生物資源省部共建國家重點實驗室培育基地，重慶，400715) 2(西南大學 化學化工學院，重慶，400715)3(西南大學 地理科學學院，巖溶環境開放實驗室，重慶，400715) 4(中國科學院 上海有機所，上海，200032)

對分離自重慶酉陽喀斯特槽谷石漠化地區土壤的1株產紅色色素的細菌進行了形態學、生理生化特性和16S rRNA序列鑒定，進一步對該色素的溶解性、抑菌性和穩定性行進了研究，測定了其最大紫外吸收波長；同時，采用硅膠色譜柱對色素進行了純化，通過薄層層析、質譜和光譜掃描對色素成分進行分析。結果顯示，該菌在30 ℃培養時，色素產量較高。該色素在無水乙醇中的溶解性優于其他有機溶劑，在530 nm處有最大紫外吸收峰；該紅色素對大腸桿菌(Escherichiacoli)及恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)無抑菌作用；對極端pH值較敏感，尤其是強堿性pH值。且其光和熱穩定性良好，耐氧化能力較強，耐還原能力較弱；金屬離子對該色素有不同程度的消色作用，Cu2+的消色作用最明顯。16S rRNA序列分析結果顯示，該菌與多株黏質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)的16S rRNA序列一致。質譜分析結果顯示，該色素的分子質量為324.2，與靈菌紅素的分子質量非常接近，但光譜掃描結果與其不一致。

靈菌紅素；粘質沙雷氏菌；色素；16S rRNA

色素包括天然色素和合成色素，廣泛用于食品、化妝品、制藥以及紡織等工業[1]。PERKINS等[2]于1856年首次合成了苯胺紫，此后，合成色素以其色澤鮮艷、著色力強、穩定性好、品質均一、無臭無味、價格低廉等優點迅速取代了天然色素。但是合成色素的毒副作用使得大家更為重視天然色素。眾多微生物如細菌、放線菌、酵母、絲狀真菌和大型真菌都產生天然色素[3]，如紅曲色素、天然藍色素、類胡蘿卜素和黑色素等[4-5]。我國對天然色素的研究開發發展迅速，在國際市場上的銷售額年增長率始終保持在10%以上[6]。目前，我國批準使用多種天然色素如茶黃色素、茶綠色素、柑橘黃、紅花黃、紅米紅、黑豆紅、黑加侖紅、花生衣紅、姜黃素、焦糖色素等43種[7]。

本研究從重慶酉陽石漠化地區的土壤分離得到1株產紅色色素的細菌，并對其進行了鑒定和該色素的性質做了初步研究探索了提取色素的參數、初步鑒定了該色素的性質。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試菌株

從重慶酉陽的花椒地采集的土壤中分離得到。

1.1.2 培養基

LB液體培養基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，加蒸餾水至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min后備用。LB固體培養基：LB液體培養基中加入瓊脂粉至終質量濃度為20 g/L。

7H9液體培養基：7H9粉末4.7 g/L，甘油0.2%，加蒸餾水至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min，冷卻后加入20%吐溫-80至最終體積分數為0.05%。7H9固體培養基：7H9液體培養基中加入瓊脂粉至終濃度為20 g/L。

1.2.3 試劑與設備

PCR擴增用試劑，寶生物(工程)大連有限公司；DNA純化回收試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；硅膠(300～400目)，煙臺化學工業研究所。PCR儀，BIO-RAD公司；酶標儀，Molecular Devices公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的分離純化

稱取10 g土壤樣品于10 mL無菌水，37 ℃搖床振蕩過夜后，離心收集上清液；將上清液制備成10-4、10-5、10-6梯度的樣品，取3個稀釋度的樣品各200 μL，分別涂布于LB固體培養基上[8]。30 ℃恒溫培養2 d，挑取產紅色素的菌落進行平板劃線法分離純化，直至得到純的菌株后，轉到LB液體培養基中，待其長到對數期時，加甘油保存于-70 ℃冰箱中。

1.2.2 菌株鑒定

1.2.2.1 菌株形態及生理生化特征

取保存的菌液涂布于LB固體培養基，30 ℃培養2 d，觀察菌落形態特征。另取菌液接種于LB液體培養，37 ℃培養1 d，經革蘭氏染色后，于光學顯微鏡下觀察其菌絲形態。

1.2.2.2 分子生物學鑒定

將培養好的菌液濃縮，沸水中煮30 min，離心收集上清，取2μL作為模板，進行16S rRNA基因擴增。16S rRNA的通用引物：27F序列為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1429R序列為5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′[9]。PCR擴增反應參數：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環，最后72 ℃延伸10 min。將PCR擴增產物用回收試劑盒純化后，送至華大基因公司測序。將所測序列在NCBI 的 GenBank 數據庫中進行BLAST比對分析。

1.2.3 紅色素性質的研究

1.2.3.1 紅色素的制備與提取

從-70 ℃取出保存菌種，接種于LB液體培養基中，37 ℃、160 r/min振蕩培養過夜。以此為種子液，按200 μL/平板的接種量均勻涂布于LB平板，并于30 ℃培養箱培養36 h。用藥匙刮下紅色菌苔，置于無水乙醇(5mL/平板)中浸提色素。充分振蕩混勻后于室溫放置1 h，4 000 r/min，離心5min棄收集上清，按上述方法再重復浸提1次。過濾色素浸提液，減壓濃縮至小體積，從而得到深紅色色素乙醇濃溶液[10]。

1.2.3.2 紅色素的光譜特征

對色素乙醇溶液作250～650 nm大范圍波長掃描，得到色素光譜圖，確定其特征吸收峰值。

1.2.3.3 紅色素的的溶解性研究

按1.2.3.1的方法制備菌苔，并分為等質量的10份，分別取定量的水、甲苯、甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯、冰乙酸、丙酮、三氯甲烷、異戊醇、石油醚等溶劑對其進行溶解，觀察其在不同溶劑中溶解的難易程度[11]。并于最大紫外吸收波長測定其OD值。

1.2.3.4 紅色素的抑菌性研究

將1.2.3.1浸提的色素乙醇弄溶液進行十倍梯度稀釋，并用0.22 μm濾器過濾除菌。以大腸桿菌和恥垢分枝桿菌為供試菌株，采用濾紙片法進行平板抑菌實驗，分別取10 μL各稀釋梯度的色素進行實驗，以確定紅色素是否具有抗菌功能。

1.2.3.5 紅色素的溫度穩定性

取色素乙醇溶液，分別于40、60、80、100 ℃恒溫水浴中孵育2 h，每隔30 min取樣，測定其吸光值。

1.2.3.6 紅色素的光穩定性

取色素乙醇溶液，分別置于白光和紫外光下，室溫靜置 0、2、4、6、8 h后取樣，測定其吸光值。

1.2.3.7 紅色素的pH穩定性

用HCl和NaOH將蒸餾水的pH值調至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，分別取5 mL各pH值的蒸餾水，再加入200 μL色素乙醇濃溶液，混勻后觀察色素在不同pH條件下的顏色變化，并于靜置后0 h和2 h測定其吸光值[10]。

1.2.3.8 紅色素對氧化還原劑的穩定性

配制體積分數10%的H2O2和質量濃度100 g/L的Na2SO3，按下表(表1)制備反應體系?；旌暇鶆蚝?，測定靜置0 h和2 h后的吸光值[12]。

表1 氧化還原反應體系

1.2.3.9 紅色素對金屬離子的穩定性

配制100 mmol/L的Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+溶液，取50 μL上述離子溶液分別加入450 μL色素乙醇溶液各，使其終濃度為10 mmol/L，混合均勻后，測定靜置0 h和2 h后的吸光值[12]。

1.2.4 紅色素的薄層層析分析

根據該色素的溶解性選用以下幾種配方的展開劑：V(甲醇)∶V(乙酸乙酯)=3∶20，V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=70∶30∶10，V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(乙酸乙酯)∶V(水)=15∶20∶40∶10，V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=1∶1，V(甲醇)∶V(石油醚)=1∶1，V(甲醇)∶V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=3∶10∶10，V(乙醇)∶V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=3∶5∶15。采用微型點樣器吸取一定量的色素乙醇溶液進行點樣，吹風吹干后置于上述展開劑中并密封，待展開劑的刻度線移至層析板前沿約2 cm時停止展開，將薄板取出晾干后拍照，采集分離圖像并計算Rf值。

1.2.5 紅色素的硅膠柱層析純化與質譜鑒定

(1)樣品準備：將預先制備好的色素乙醇溶液用旋轉蒸發儀蒸至溶液還剩余2～3 mL時，加入少量的300～400目的硅膠，振搖，繼續旋蒸直至蒸干，最后用刮刀刮下瓶中紫色固體備用。

(2)裝柱：本實驗采用濕法裝柱、干法上樣。稱取適量的硅膠(300～400目)放入燒杯中，然后加入石油醚，使液面高出硅膠面2 cm，然后準備1支較長的玻璃棒，在裝柱時邊倒硅膠石油醚混合液邊攪拌，使硅膠均勻沉降。并用雙連球加壓，壓實硅膠柱。然后打開層析柱開關，放走多余的石油醚，待石油醚液面高出硅膠液面1～2 cm時關掉開關。

(3)上樣：在層析柱頂端放上干燥的三角漏斗，小心將樣品通過三角漏斗加入層析柱中，盡量使該固體平鋪在硅膠面上，用適量石油醚洗下三角漏斗和層析柱壁上的固體。并用洗耳球清輕敲層析柱，使其平整。再通過三角漏斗加入適量無水碳酸氫鈉，同時加適量石油醚，使無水碳酸氫鈉約1.5 cm厚。

(4)洗脫：向層析柱加入40 mL石油醚，打開層析柱開關，當石油醚接近碳酸氫鈉界面時，用滴管緩慢加入洗脫劑[V(無水乙醇)∶V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=1∶5∶15]。并用試管收集流出液。

(5)濃縮：將收集到的橙紅色溶液一起旋蒸，再將得到固體色素用少量甲醇溶解，保存于4 ℃冰箱。

(6)取2 mL純化后的色素甲醇溶液送往中科院上海有機所進行質譜鑒定與紅外掃描。

2 結果與分析

2.1 菌株的形態鑒定

該菌株在LB平板上培養2 d后，菌落呈現鮮紅色，且邊緣整齊，表面光滑，中間有小凸起。革蘭氏染色結果為陰性。

2.2 菌株的分子生物學鑒定

將16S rRNA的測序結果經BLAST比對發現，該細菌與多株粘質沙雷氏菌的16S rRNA序列一致，故初步推測該細菌屬于粘質沙雷氏菌，因此其產生的色素可能就是靈菌紅素。

2.3 紅色素的紫外吸收光譜分析

紅色素的紫外光吸收光譜見圖1，250～650 nm波長掃描結果顯示，該紅色素乙醇溶液在530 nm處具有最大吸收峰，與靈菌紅素的紫外吸收光譜一致，因此進一步證明該色素可能為靈菌紅素。

圖1 紅色素的紫外吸收光譜Fig 1 The ultraviolet absorption spectra of the red pigment

2.4 紅色素的溶解性研究

將紅色素用不同的有機溶劑溶解，測得的OD530nm值見表2。結果表明，該紅色素極易溶于無水乙醇和甲醇溶液，在水和丙酮中也能較好地溶解，表明該色素具有較強的極性；但在乙酸乙酯等其他幾種有機溶劑中均不溶解，這與靈菌紅素的脂溶性不一致。

表2 紅色素的溶解性

2.5 紅色素的抑菌性研究

實驗中選取了2種菌做抑菌實驗，37 ℃培養24 h后，結果見圖2。從圖2可看出，紙片四周沒有透明圈，表明該紅色素對供試菌株的生長沒有明顯的抑制作用，因而該紅色素對大腸桿菌和恥垢分枝桿菌無抑菌作用。

(a)紅色素對大腸桿菌的抑制效果；(b)紅色素對恥垢分支桿菌的抑制效果圖2 紅色素的抑菌實驗Fig 2 The bacteriostasis experiments of the red pigment

2.6 紅色素的穩定性研究

2.6.1 紅色素的溫度穩定性

如圖3所示，該色素在40 ℃和60 ℃時消色不明顯，在80 ℃和100 ℃放置1 h后吸光值下降了十幾個百分點，但后面就逐漸趨于穩定。在100 ℃放置2 h后，色素殘留量還能達到87%以上，表明該紅色素具有極強的溫度穩定性。

圖3 溫度對紅色素穩定性的影響Fig.3 Effects of temperature onthe stability of pigment

2.6.2 紅素色的光穩定性

如圖4所示，白光和紫外光對該色素的穩定性均無明顯影響，持續照射8 h后，色素的殘存率仍保持在95%以上，表明該紅色素具有極強的光穩定性。

圖4 光照色素穩定性的影響Fig.4 Effects of light on the stability of pigment

2.6.3 紅色素的pH穩定性

如表3所示，該紅色素在強酸性和強堿性溶液中均有沉淀生成。但其在酸性溶液中相對穩定，在pH4～6之間時，其殘存率保留90%以上；但顏色有微弱的變化，和原樣相比，其顏色呈水紅色。在pH11～12之間，顏色呈橙黃色，明顯變淺，且其殘存率在pH12的時候已不到50%。在pH7～10之間，色素基本保持其原本的顏色和紫外吸收值。

表3 pH對紅色素穩定性的

2.6.4 紅色素對氧化還原劑的穩定性

如圖5所示，隨著氧化劑10% H2O2加入量的增加，色素的吸光值略有下降；終濃度1%時，其殘存率還保留了66%以上，表明該紅色素的抗氧化能力較強。而隨著還原劑100 g/L Na2SO3加入的增加，色素的吸光值急劇下降；當其濃度為20 g/L時，OD值下降了72.84%，最低殘留量僅有12.4%，表明還原劑對該紅色素有很強的消色作用。

圖5 氧化還原劑對色素穩定性的影響Fig.5 Effects of oxidizers and reducers on the stability of pigment

2.6.5 金屬離子對紅色素穩定性的影響

如表4所示，Na+和K+對色素的穩定性基本沒有影響，而Li+、Ca2+和Mg2+對色素有一定程度的增色作用，其中，Li+的增色作用最明顯。Cu2+使色素溶液變成了灰藍色，吸光值大大降低。Fe2+和Fe3+加入后，生成了沉淀，顏色沒有明顯變化；而Zn2+和Mn2+使色素溶液變成了水紅色，同時伴隨沉淀的生成。

表4 金屬離子對色素穩定性的影響

2.7 紅色素的薄層層析分析

采用不同的展開劑對該色素進行分離，結果如表5所示，僅V(甲醇)∶V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=3∶10∶10與V(乙醇)∶V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=3∶5∶15能將其展開，但前者Rf值較大，展開效果不理想；后者Rf值接近0.5，展開效果最佳。

表5 不同展開劑對紅色素的展開情況

2.8 紅色素的硅膠柱層析純化與質譜鑒定

圖6 紅色素的質譜鑒定圖譜Fig.6 The mass spectrum of the pigment

經硅膠柱層析得到16 mg的固體色素。質譜鑒定如圖6所示。結果顯示，其分子量為324.2，與靈菌紅素的分子量非常接近，但紅外掃描結果與靈菌紅素不符，推測該色素可能是靈菌紅素的類似物。

3 結論與討論

近年來，隨著工業與生物醫藥技術的發展，天然色素以其安全可靠、來源廣泛的特點，將重新取代大部分合成色素。靈菌紅素更是具有多種生物學活性，研究表明靈菌紅素具有抗腫瘤、抗菌及免疫抑制劑活性[13]。MELVIN等[14]研究發現靈菌紅素對腎癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、白血病、黑素瘤、中樞神經系統癌等8種癌細胞系中的57種不同人癌細胞均有起抗性作用。

天然的靈菌紅素類化合物均含有一個共同的吡咯——雙吡咯亞甲基的環狀結構骨架。根據其側鏈基團的不同，靈菌紅素家族還包括靈菌紅素25C(Prodigiosin 25-C)、鹽酸環狀靈菌紅素(Cycloprodigiosin hydrochloride)、間環靈菌紅素(Metacyaloprodigiosin)、壬基靈菌紅素(Nonylprodigiosin)和環壬基靈菌紅素(Cyclononylprodigiosin)[15-17]。體外抑菌試驗表明，靈菌紅素類物質對金黃色葡萄球菌及福氏志賀菌等革蘭氏陽性細菌具有良好的抑菌作用[14]。因此靈菌紅素具有獨特的研究價值和應用潛能。

本研究分離得到的菌株經16S rRNA序列鑒定得知為粘質沙雷氏菌。對其產生的紅色素性質進行研究發現，該色素與靈菌紅素具有很多相似性，如穩定性好，紫外吸收光譜一致，且均具有良好的抗氧化能力。但本研究提取的色素不溶于脂類溶劑，且其紅外光譜與靈菌紅素不一致；根據以上這些結果推測，該色素可能是靈菌紅素的類似物，或許存在一些未知的功能，因此還需進一步研究。由于本研究鑒定得到的分子量與靈菌紅素極為接近，因此要獲知其側鏈基團與靈菌紅素有何不同，還需對其分子結構作進一步解析。

致謝：感謝第三軍醫大學胡川閩教授和寰瑞生物技術有限公司唐世清博士。

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The identification of prodigiosin family red pigment producing bacterium and characterization of the red pigment

LI Chun-yan1, MOU Xi1, ZHANG Yuan1, CHEN Yao2, YANG Da-cheng2,ZHENG Hu-zhi2, ZHENG Bo4, ZHOU Jia-hai4, JIANG Yong-jun3, XIE Jian-ping1*

1(Institute of Modern Biopharmaceuticals, State Key Laboratory Breeding Base of Eco-Environment and Bio-Resource of the Three Gorges Area, Key Laboratory of Eco-environments in the Three Gorges Reservoir Region,Ministry of Education, School of Life Sciences, Southwest University，Chongqing 400715,China) 2(School of Chemistry and Chemical Engineering, Southwest University，Chongqing 400715,China) 3(Karst Environment Laboratory, School of Geographical Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China) 4(Chinese Academy of Sciences, Shanghai Institute of Organic，Shanghai 200032,China)

Natural pigments are frequently used in food and dye industry. A bacterium producing red pigment was isolated from the Karst soil of Chongqing. The red pigment was characterized. The bacterium was identified asSerratiamarcescensby 16S rRNA sequencing. The optimum temperature for the bacterium to yield maximum pigment was 30 ℃. The maximum absorption peak of the pigment was at 530 nm. The pigment could be dissolved in different reagents, while the optimal extraction reagent was ethanol. It was quite stable over temperature, light and antioxidant, while unstable under reducing agent or alkaline condition. Cu2+could decolorize the pigment. The purified pigment did not show inhibitory effect upon Escherichia coli orMycobacteriumsmegmatis. The mass spectrum of this pigment was similar to that of prodigiosin.

prodigiosin;Serratiamarcescens; pigment; 16S rRNA

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701001

碩士研究生(謝建平研究員為通訊作者,E-mail：georgex@swu.edu.cn)。

國家自然科學基金(41472321)；國家重點研發項目(2016YFC0502304)

2016-07-18，改回日期：2016-08-29